微管骨架在登革病毒感染ECV304细胞中作用的初步研究

目的研究登革病毒在与ECV304细胞相互作用过程中细胞微管骨架的变化,以及微管在病毒释放过程中的作用.方法用2型登革病毒感染ECV304细胞株,间接免疫荧光双染色技术观察微管和病毒抗原的分布;应用colcemid破坏微管骨架,检测细胞内外病毒滴度的变化,以明确微管是否参与病毒的复制.结果登革病毒感染后ECV304细胞微管骨架的排列发生明显的变化,表现为3种类型:无序排列;围绕核形成环状结构;微管结成束状形成线状突触.间接免疫荧光双染色结果显示登革病毒抗原与微管共染,分布在微管组织中心.感染后8 h,药物组上清中的病毒滴度高于一般感染组,而细胞内的病毒滴度低于一般感染组.结论登革病毒感染引起ECV304细胞微管的排列发生变化,可能是病毒感染造成了微管解聚,后者促进病毒的释放;药物的添加,加剧了对微管的破坏程度,从而进一步促进了病毒的释放.     

肌肽对ECV304细胞缺氧损伤的保护作用

目的 研究肌肽对缺氧所致人体内皮细胞系ECV304细胞损伤的影响.方法 建立缺氧条件下ECV304细胞损伤模型,用MTT法观察肌肽对缺氧损伤的ECV304细胞活性的影响,测定细胞培养基中乳酸脱氨酶(LDH)活力,并对细胞骨架进行考马斯亮蓝R-250染色观测其细胞结构.结果 浓度为10～20 mmol/L肌肽孵育ECV304细胞6 h后,可以抑制缺氧12 h和24 h引起的ECV304细胞活性下降,同时减少LDH的释放,保持细胞骨架完整.结论 肌肽对缺氧所致的ECV304细胞伤具有保护作用.     

人巨细胞病毒诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡

目的 探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染ECV304血管内皮样细胞的致病机制。方法 常规方法传代细胞和接种病毒。以PCR法和间接免疫荧光法检测病毒即刻早期基因（IE gene）及其蛋白表达;相差显微镜及电子显微镜观察病毒感染后细胞和细胞器形态变化;DNA梯度法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果 病毒感染后72h开始出现胞体变圆、缩小、脱壁,胞质内颗粒增多,细胞边缘模糊不清的特征,可明显检测出病毒特异IEgene及其蛋白表达;电镜结果显示病毒感染96h后,胞质内明显空泡化,细胞膜微绒毛减少,核染色质浓集、边缘化,线粒体出现溶酶体化、空泡化和自噬现象,呈早期凋亡特征;DNA梯度电泳结果显示感染细胞DNA片段化特征的条带：流式细胞仪检测发现感染4d和6d时,细胞调亡率分别为4．1％和45．7％。结论 巨细胞病毒在体外细胞培养中可诱导ECV304血管内皮样细胞的凋亡。     

低浓度葡萄糖诱导ECV304细胞损伤机制的初探

目的 探讨低浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞损伤的可能机制.方法 以人脐静脉内皮细胞株ECV304为细胞模型,用低浓度葡萄糖刺激ECV304细胞,流式细胞仪测定12h内不同时间点细胞ROS产量,之后用低浓度葡萄糖及NADPH氧化酶抑制剂apocynin联合刺激ECV304细胞12 h,用流式细胞仪测定ROS产量,MTT法测定细胞活力,光泽精化学发光法测定NADPH氧化酶活性.结果 低浓度葡萄糖能够显著增加ECV304细胞ROS产量,ROS产量具有时间依赖性和葡萄糖浓度依赖性,低糖能增加NADPH氧化酶的活性.用NADPH氧化酶抑制剂apocynin预处理细胞,能使2.8mmol/L组活性氧产量降低44%,细胞活力提高32%,0mmol/L组活性氧产量降低60%.结论 低糖可以显著增高ECV304细胞氧化应激水平而参与内皮细胞损伤,其部分机制可能与NADPH氧化酶激活有关.     

神经肽Urocortin抑制ECV304细胞和鼠平滑肌细胞的增值

目的：本实验目的在于研究Urocortin(Ucn)对内皮细胞(一种取自人脐静脉内皮细胞HUVEC ECV304)以及大鼠动脉平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)增值的影响，从而探讨其在血管重构(Vascular Remodeling，YR)中的作用。方法：通过四唑盐比色法研究Ucn对内皮细胞以及鼠平滑肌细胞增值的影响。结果：Ucn(10^-7mol／L)抑制ECV304和VSMC细胞的增值。这种抑制作用不依赖于作用时间也不受ATP敏感的钾离子通道阻滞剂glybenclaimide(Gly，10μmol/L)的影响。结论：提示Ucn不依赖钾离子通道的作用来控制血管重构。可能对高血压的脑或其他器官的并发症有防治作用，可以作为一种新的血管活性药物。     

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的构建含有大鼠β-NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础.方法设计一对含有HindⅢ及Sal Ⅰ酶切位点的β-NGF基因上下游引物,PCR法扩增含有大鼠β-NGF cDNA的质粒pUC19-β-NGF,产物经HindⅢ及Sal Ⅰ双酶切,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-β-NGF,经Pme Ⅰ酶线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转入BJ5183中进行同源重组,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析,阳性克隆经293细胞包装,扩增,空斑法测定病毒滴度,转化体外培养的星形胶质细胞.通过RT-PCR、ELISA、Western blot法检测其在星形胶质细胞中的表达. 结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体pAd-β-NGF,重组腺病毒在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011 PFU/ml.病毒上清液经ELISA 检测,β-NGF表达的量为(94.50±4.58) ng/L.结论该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础.     

ECV304对4种病毒的敏感性研究

ECV30 4(U mbilical cord,endothelial,hum an)为正常人脐带静脉自发转化的永生性内皮细胞株。细胞多呈梭形和不规则三角形 ,具有单层生长的特点。为了寻找更多的对病毒范围较广的敏感细胞株 ,我们对 ECV30 4用 4种理化和生物学特性均不同的病毒单纯疱疹病毒 (HSV- 333)、柯萨奇病毒 (CBV4)、腺病毒 (Ad V7)、人巨细胞病毒 (HCMV1 6 9)进行了敏感性研究。1 　材料与方法1 .1 　材料　 ECV 30 4购于武汉大学培养物保存中心 ,病毒株 HSV- 333、CBV4、Ad V7、HCMV1 6 9均为本室保藏。MEM、小牛血清均购于 Gidco公司。1 .2 …     

温度时间及125I-AS浓度对ECV304细胞AS受体内化的影响

目的 探讨温度、时间及125碘-血管抑素(125I-angiostatin,125I-AS)浓度等因素对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞血管抑素(angiostafin,AS)受体内化的影响.方法 利用弹性蛋白酶有限水解法制备AS,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,Ch-T法进行125I标记,纸层析法测标记率,Sephadex-G50柱纯化,将纯化产物分别加入牛血清白蛋白(BSA)、生理盐水及不同物质的量比的半胱氨酸,以观察其体外稳定性.利用放射性配基结合分析法,以125I-As为放射性配基,于4、24、37℃条件下,固定浓度125I.As与ECV304细胞共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率;37℃条件下,不同浓度125I-As与ECV304细胞共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率.结果 蛋白水解产物凝胶电泳相对分子质量为38×103,标记率可达85%,标记产物在体外较稳定.4℃时,受体内化率较低,24℃时,受体内化率有所增加,37℃时,受体内化率较高;37℃时,随125I-As浓度增大,受体内化率降低(P＜0.01);不同温度、浓度时,受体内化率均随时间延长而增加(P＜0.01,P＜0.05).结论 ECV304细胞AS受体内化受温度、时间及125I-AS浓度等因素影响,呈温度-效应、时间-效应关系,与125I-AS浓度呈负相关.     

小鼠PPARδ腺病毒载体的构建及其在INS-1细胞中的表达

目的 构建含有小鼠过氧化物酶增殖激活受体δ(peroxisome proliferate activated receptor delta,PPARδ)基因的重组腺病毒表达载体.方法 通过Kpn Ⅰ和EcoRⅤ双酶切,从pCDNA3.0-mPPARδ载体中得到含有小鼠PPARδ全长编码序列的片段,将mPPARδ与pAdtrack-CMV相连接并用Pme Ⅰ线性化后,转化含有pAdeasy骨架质粒的细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到pAd-mPPARδ质粒.pAd-mPPARδ经Pac Ⅰ线性化后用LipofectamineTM 2000转染HEK293细胞,包装得到含PPARδ基因的病毒重组子,将病毒重组子在HEK293细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含PPARδ的病毒液.将收集的病毒液感染INS-1细胞,绿色荧光观察GFP和Western blot检测PPARδ蛋白的表达.结果 成功构建了含有小鼠PPARδ基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为1.5×1010 pfu/ml.重组腺病毒感染后可使INS-1细胞PPARδ蛋白表达明显增加.结论 该重组腺病毒载体的构建为研究PPARδ基因在胰岛细胞中生物学功能提供了一定的工作基础.     

Bek腺病毒表达载体的构建及其在哺乳类动物细胞中的表达

目的构建Bek腺病毒表达载体并观察该载体在成纤维细胞中转基因表达FGFR2-Ⅲc的情况,为研究骨骼发育打下基础.方法利用AdEasy-1腺病毒载体系统构建Bek腺病毒表达载体;该载体感染成纤维细胞后,通过荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA情况.结果Bek腺病毒表达载体感染成纤维细胞后,成纤维细胞有绿色荧光表达,荧光定量PCR检测表明Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA效果明显(P＜0.05).结论Bek腺病毒表达载体构建成功,能够转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA,为研究骨骼发育和成骨机制提供了基础.     

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的构建人内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,并在ECV 304中获得表达. 方法将ESM-1 cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中,转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交,免疫组化检测ESM-1基因的表达.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实,转染后发现ESM-1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加. 结论成功构建了人 ESM-1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV304, 并获得高水平的表达,为进一步研究作好准备.     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响

目的:构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA-7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法:通过基因操作技术将启动子(hTERTp) 目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同时构建对照病毒AdTP-EGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA-7在肿瘤细胞株中的表达状态;通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果:成功构建携带目的基因的腺病毒载体,PCR鉴定正确;蛋白质印迹结果表明MDA-7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡,如A549,SGC-7901等,在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时,原代细胞中没有检测到MDA-7表达;结晶紫染色试验结果表明AdTP-mda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTP-EGFP。结论:成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。     

反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建反义BTEB2重组腺病毒载体 ,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响。　方法 :从培养的大鼠VSMC中提取总RNA ,通过RT PCR制备BTEB2cDNA ,将BTEB2cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC31 5中 ,构建重组穿梭质粒pDC31 5ASBTEB2 ,将其与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1 ,3Cre共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,采用PCR方法对其进行鉴定 ;用重组腺病毒感染VSMC ,通过RT PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达。　结果 :在病变 2 93细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒 ,其滴度为 5×1 0 9ml。VSMC被重组腺病毒感染后 ,可检测到BTEB2反义RNA的表达。　结论 :成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体 ;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA ,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础     

低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

目的：构建携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF）,观察其在内皮细胞中的表达。 方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1α cDNA 设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。 结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为（48.93±3.86）ng/mL。 结论：本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。     

复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究

目的：探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。方法：以RT-PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素-1（Ang-1）全长cDNA，测序鉴定正确后，经salI酶切并克隆到E1、E3缺失的Ad5腺病毒载体（PAxCAwt）中，应用cosmid-TPC磷酸钙共沉淀法，将含有左向转录表达单元重组载体PAxCAwt Ang-1与DNA-末端肽复合物（TPC）-同转染293细胞中，经挑选克隆、病毒扩增、纯化、浓度滴度测定，制备了纯化病毒颗粒，以此转染人脐静脉上皮细胞（ECV304），收集转染后1-7天的细胞，用RT-PCR检测转染细胞中外源性Ang-1基因转录。结果：实验所克隆的Ang-1 DNA片段为含有信号肽结构的长度为1515bp的全长cDNA，与文献报道一致。外源基因在转染细胞中能有效转录。结论：Ad5-PAxCAwt转导的血管形成素-1基因可在体外有效表达转录。     

人SMOC1重组腺病毒载体的构建及其在主动脉瓣间质细胞中的表达

目的:利用AdEasyTM vector system构建携带人SMOC1基因的重组腺病毒表达载体,感染人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)并检测外源性SMOC1在细胞中的表达和对细胞增殖的影响?方法:用PCR的方法扩增SMOC1 cDNA,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并测序鉴定?经NotⅠ和XhoⅠ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-CMV-SMOC1?将经PmeⅠ线性化的pShuttle-CMV穿梭载体与pAdEasyTM DNA电穿孔共转化BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒pAdEasy-SMOC1,再将经PacⅠ线性化的重组病毒骨架质粒转染HEK293A包装细胞,包装并扩增重组腺病毒(Ad-SMOC1)?用Ad-SMOC1感染hAVICs,以Western blot法和免疫荧光染色法检测重组SMOC1在hAVICs中的表达与定位,用MTS法检测SMOC1对主动脉瓣间质细胞增殖的影响?结果:成功构建并包装表达SMOC1蛋白的重组腺病毒,该重组腺病毒在体外能有效感染hAVICs并高表达SMOC1蛋白,且其介导表达的SMOC1蛋白主要定位于hAVICs的胞浆和胞膜上,MTS分析表明重组SMOC1能够显著促进主动脉瓣间质细胞的增殖? 结论:成功地构建了携带人SMOC1基因的重组腺病毒,并证实SMOC1具有促进增殖的作用?本研究为进一步研究SMOC1在瓣膜间质细胞中的作用奠定了实验基础?     

大鼠AQP7基因重组腺病毒载体的构建及其在3T3-L1脂肪细胞中的表达

目的:构建携带大鼠AQP7基因的腺病毒载体,并检测其在3T3-L1脂肪细胞中的表达。方法:采用RT-PCR方法,从大鼠脂肪组织中扩增克隆大鼠AQP7基因,插入到穿梭质粒中获得重组质粒pDC316-AQP7。PCR、酶切鉴定后,重组穿梭质粒和骨架质粒经脂质体2000转染293细胞出毒产生重组腺病毒。经PCR进行鉴定,转染293细胞扩增并纯化,半数组织培养感染剂量(TCID 50)方法测定腺病毒滴度。体外转染分化成熟的3T3-L1细胞,用Western blot方法检测AQP7的表达水平。结果:PCR、酶切及测序证实重组穿梭质粒构建正确。同时成功构建AQP7重组腺病毒,并制备出高滴度的病毒保存液,可以有效转染3T3-L1细胞。结论:成功构建了含大鼠AQP7基因的重组腺病毒载体且其可以在3T3-L1细胞中有效表达,为今后更好地研究AQP7在肥胖发生发展过程中的调控机制奠定了基础。