含双乳糖启动子质粒pLJ3的改建

用EcoRI部分酶切质粒pLJ3,将其粘末端变成平末端,进行平末端连接;再用EcoRI完全酶切,进行粘末端连接,最后我们消去了pLJ3质粒Lacuv5启动子上游的EcoRI酶切位点,得到了一种新质粒pFGI。pFGI含有两个串联的Lacuv5启动子片段,其中包括Lacuv5启动子,操纵基因及LacZ基因的SD序列和一个四环素抗性基因,紧挨LacZ基因的SD序列后,有一EcoRI酶切位点,可方便地插入外源基因,为外源基因在大肠杆菌中的表达提供有效的启动子和核糖体结合所需的SD序列。     

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段,与带有相同酶切位点的ｐＬＸＳＮ逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析。证明反义载体构建成功。结论 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增插入ＤＮＡ片段,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建     

含报告基因的凋亡素基因真核表达载体构建研究

目的构建含报告基因的凋亡素基因真核表达载体。方法对pMD18T-VP3质粒进行EcorI和BamHI双酶切,回收366 bp（含凋亡素基因完整序列）片段。对增强型绿荧光蛋白pEGFP-C2质粒酶切,回收载体大片段。将凋亡素基因通过连接反应,连接到增强型绿荧光蛋白（EGFP）基因C末端的终止密码前,并使两者读框不移位,构建成pEGFP-VP3质粒,并对其进行酶切分析和测序鉴定载体结构。结果通过对构建的pEGFP-VP3质粒酶切、电泳,出现了366 bp的电泳条带,与凋亡素基因片段一致。凋亡素基因真核表达载体测序鉴定结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Genbank中报告的凋亡素基因序列一致,同源性为100%。结论将凋亡素基因连接于增强型绿荧光蛋白的C末端,成功构建了凋亡素—增强型绿荧光蛋白表达载体pEGFP-VP3。     

一种新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建

目的：构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法：利用基因重组技术,对已有载体pPIC9K进行改造：除去信号肽末端的XhoI酶切位点,在多克隆位点处添加此切点;添加一个多聚组氨酸纯化标签;重建了阅读框架。结果：成功构建了一个多拷贝毕赤酵母表达载体。结论：可以利用这个表达载体对外源基因进行分泌表达。     

融合蛋白人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原核细胞中的表达

目的：构建人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican3, GPC3）重组原核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因产物,与pMD-18 simple T 载体进行连接构建出T克隆载体;从T载体上获取基因片段,并对pET-32a（＋）空载体进行双酶切,用T4连接酶连接,构建出pET-32a（＋）-GPC3原核表达载体;对构建好的载体再次测序,并进行诱导表达。结果 PCR产物长度为837 bp,即扩增的GPC3 C末端长度,与NCBI网站的相比较,序列完全一致,说明pET-32a （＋）载体中正确插入了目的片段,并且诱导表达出蛋白。结论成功构建了融合表达Pet-GPC3载体,蛋白诱导表达成功。     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

maspin/PCR2.1表达载体的构建及意义

目的:构建maspin/PCR2.1表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法:PCR扩增maspin基因全长,将表达载体PCR2.1用Hind111 XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到人肝癌高转移细胞株MHCC-97中进行表达,检测转染前后maspin表达的变化.结果:重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增;提纯、纯化后,用HindⅢ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到PCR2.1表达载体,并在人肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达.结论:成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,能在真核细胞中.     

Endostatin基因真核表达载体的构建及活性鉴定

目的：构建endostatin基因的真核表达载体,并将其转染C6脑胶质瘤 细胞,探讨其体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR将大鼠血清蛋白分泌信号连接在endostatin基因的碳末端,构建成真核表达载体pcDNA3-Sendostatin,利用Lipofectamine法将其转染C6脑胶质瘤细胞,采用细胞增殖实验进行endostatin表达蛋白体外活性鉴定。结果：成功构建了endostatin基因真核表达载体,转染该载体的C6脑胶质瘤细胞可分泌表达抑制血管内皮细胞增生的endostatin蛋白。结论：endostatin是一种有效的血管生成抑制剂,可进一步用于在体肿瘤的抗血管生成治疗。     

αB型干扰素基因在大肠杆菌中的表达

通过Bal-31外切酶剪切及T4 DNA连接酶平端连接等DNA重组技术,将αB型干扰素基因切成长度不一的平末端片段,插入pUR222运载体的乳糖启动子下游的β半乳糖苷酶结构基因中,经转化大肠杆菌BMH71-18,共挑选了766个转化子,用微量细胞病变抑制试验进行快速筛选,获得15个具有抗病毒活性的阳性株,其中pSM2317菌株经14次培养检测,干扰素的平均表达放价为1.1×10~8U/L。     

巨噬细胞炎性蛋白4的突变和原核表达

目的 探索如何抑制嗜酸细胞的趋化作用，选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4（MIP4）的突变性（Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂，将Met-MIP4基因在原核细胞中进行表达。方法 设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变，将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸，以正常人肺酸突变，将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸。以正常人肺cDNA文库为模板，PCR方法获取Met-MIP4基因，克隆入载体pUC19，测序验证序列已得到突变，将正确的基因插入到GST融合表达载体pGEX-4T中，以IPTG诱导表达。结果 PCR产物为220bp左右的片段，连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变，构建的pGEX-4T融合表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约34kU的新生融合蛋白表达。结论 成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因，SDS-PAGE表明，与GST融合的Met-MIP4突变体已得到表达，为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

人maff基因表达载体构建的实验研究及意义

[目的]构建人maff基因表达载体并在人肝癌细胞系HepG2细胞中表达。[方法]PCR（聚合酶链式反应）扩增人maff基因,并将其和克隆质粒连接,转染到大肠杆菌中扩增,酶切鉴定,然后将目的基因和表达载体连接,转染到人肝癌细胞系HepG2细胞中表达并用westernblo（t蛋白质印记）进行鉴定。[结果]经酶切和westernblot鉴定,人maff基因表达载体可在真核细胞内表达Maf F蛋白。[结论]该实验构建了人maff基因真核表达载体,为进一步研究中药预防肿瘤发生提供实验基础。     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究

目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达,以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列,选择酿酒酵母偏爱的密码子,设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段,进行人工合成,并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后,将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连,并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ,经鉴定表明,获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中,检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。     

人胆固醇酯水解酶基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建含有人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因的慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH-IRES-EGFP,为hCEH基因治疗缺血性脑卒奠定基础。方法应用聚合酶链反应方法扩增目的片段,在目的基因进行上、下游分别加上PacI和AscI两个酶切位点,经双酶切后,转化入感受态DH5d细胞中,通过筛选获得重组质粒。将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果目的基因与慢病毒表达载体pLenti6．3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP构建与预期相匹配,包装细胞293T呈绿色荧光。结论成功构建了携带hCEH基因的慢病毒载体。     

杆状病毒多基因表达系统介导的轮状病毒样颗粒表达与组装

目的 构建能同时表达轮状病毒vp2、vp6、vp7基因的重组家蚕杆状病毒,并在BmN细胞中进行初步表达.方法 利用MA104细胞繁殖人A组轮状病毒,RT-PCR扩增病毒结构蛋白vp2、vp6、vp7基因,连接至转移载体pFBDM和pUCDM中,同时引入含IE1启动子的绿色荧光蛋白基因利于检测感染和表达量,再分别通过Tn7及Cre-LoxP重组构建重组病毒.为方便检测基因的表达,在VP7的C-末端添加6-组氨酸(6-His)标签,可通过ELISA等方法快速检测目的 基因表达.结果 扩增获得了轮状病毒三个结构蛋白基因,构建了能高效组装轮状病毒样颗粒的重组表达载体,ELISA检测VP7得到了表达,在BmN细胞中观察到病毒样颗粒.结论 成功构建杆状病毒多基因的表达系统,为生产多哑基蛋白复合物,研究大分子结构提供借鉴.     

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。     

抗菌肽Aurein1.2基因的同向串联及其克隆载体的构建和鉴定

目的: 构建抗菌肽Aurein1.2基因多拷贝串联体,并将目的基因串联产物克隆到载体pUC18上.方法: 分别合成含相同黏性末端的Aurein1.2单拷贝基因、EcoRⅠ前接头及SalⅠ后接头.单拷贝基因分别与前、后接头连接,通过控制基因和接头加入的量及时间,可得到两侧有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的同向串联的多拷贝基因,选取合适拷贝数的基因,将其克隆到载体pUC18上.结果: PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功.结论: 该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步克隆到表达载体并进行高效表达打下基础.     

狂犬病毒融合基因pVax-G/N的克隆

目的构建狂犬病病毒G基因和N基因的融合表达载体,为研究融合基因疫苗打下基础。方法利用分子生物学技术从质粒pVax-G中克隆出狂犬病毒G和N基因,经连接及鉴定成功后与酿酒酵母表达载体pYes2连接,并进行酶切及测序鉴定。结果融合基因pVax-G/N测序结果与预期完全符合。结论成功构建了融合表达载体pYes2-pVax-G/N,为进一步研究稳定、安全的狂犬病疫苗奠定基础。     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

巨噬细胞炎性蛋白4的非融合表达载体的构建和表达

目的探索如何抑制嗜酸性粒细胞的趋化作用,选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4(MIP4)的突变体(Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂,将Met-MIP4基因在原核细胞中进行非融合表达. 方法设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变,将MIP4 N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸.以正常人肺cDNA文库为模板,PCR方法获取Met-MIP4基因.克隆入载体pUC19,测序验证序列已得到突变.将正确的基因插入到非融合表达载体pBV220中进行表达.结果 PCR产物为220 bp左右的片段,连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变.构建的pBV220非融合表达载体在大肠杆菌DH5-α中表达,经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约8×103的非融合蛋白表达.结论成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因.Tricine-SDS-PAGE表明,非融合的Met-MIP4突变体已得到表达,为进一步研究其对哮喘的生物治疗奠定了基础.