仅采用 PCR 进行分子克隆的方法探索

目的：针对目前各种费时且易失败的克隆方法和价格昂贵的试剂盒等问题,对一种仅采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）分子克隆方法进行了探索。方法利用高保真的 DNA 聚合酶具有3＇-核酸外切酶活性的特点,采用 PCR 把载体和插入片段扩增出来,二者的扩增产物先加限制性内切酶 DpnI 后再按一定比例混合来消化甲基化的 DNA 模板,最后把DpnI 消化产物直接转化到感受态细胞来得到克隆基因。结果是一种简单、高效、可靠、且仅采用 PCR 的分子克隆方法,并利用此方法成功地把构建在载体 pET 上的α-突触核蛋白全长基因和构建在 pCDNA3.1上的乙酰胆碱受体亚基的全长基因分别重新构建在载体 pGEX-4T-1和 pGEMHE 上。结论在 PCR 扩增时能够通过引物设计来确定克隆位点,所以该方法可以把任何 DNA片段插入到质粒载体内的任何位置,而不需要考虑载体多克隆位点限制的问题。此外,该方法省去了传统的酶切消化、纯化回收和连接过程。     

EBV—DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒基因全序列，设计包括ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一相ＳａｌⅠ切点，以便于克隆，选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一１４６０ｂｐ的特异条带，纯化后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶的全基因片段。     

DNA聚合酶ξ的研究概况

近年来 ,随着真核细胞ＤＮＡ体外模型的建立 ,蛋白纯化技术的提高 ,以及对ＤＮＡ聚合酶基因的克隆 ,对真核细胞ＤＮＡ聚合酶研究取得了很大进展 ,目前已经在人体细胞中发现了 15种ＤＮＡ聚合酶 ,并分为以下 4类 :Ａ类 ,包括γ、θ及其它聚合酶 ,γ是目前发现的唯一存在于线粒体的聚合酶 ;Ｂ类 ,包括α、δ、ε和ζ ,主要参与ＤＮＡ复制和修复 ,ＤＮＡｐｏｌα主要在ＤＮＡ半保留复制中起作用 ,ＤＮＡｐｏｌδ和ε参与核苷酸切除修复 ,增殖性细胞核抗原 (ＰＣＮＡ)对它们的辅助作用是相近的 ;Ｘ类 ,包括β、λ、μ和σ ,ＤＮＡｐｏｌβ参与短…     

人肺癌组织中DNA聚合酶β表达及意义

目的:通过检测DNA聚合酶β(DNApolymerasebeta,DNApolβ)基因在人肺癌,人正常肺组织中蛋 白水平的表达情况来探讨其在肺癌发生发展过程中的作用和意义。方法:应用免疫组化的方法对67例肺癌, 27例正常肺组织中DNApolβ进行定位及蛋白表达低下率的比较,建立数据库,采用SPSS10.0软件对数据进 行统计学分析,以揭示DNApolβ蛋白表达与肺癌发生的关系。结果:在肺癌组织中,有50.7%(34/67)的人 DNApolβ表达低下;正常肺组织中,有14.80%(4/27)的人表达低下,二者表达低下率存在显著差异,χ2= 10.31,P<0.05,OR=5.92,95%C.I为(2.00,17.51),提示DNApolβ表达低下是肺癌发生的一个危险因素。 且DNApolβ表达与暴露因素如:肿瘤家族史、性别、吸烟状况有关,吸烟可以抑制其表达。肺鳞癌,细胞癌的 低下率远高于其他组织类型,有依鳞癌、小细胞癌、腺癌和其他类型依次降低的趋势χ2trend=9.36,P=0.02。 DNApolβ蛋白表达与TNM分期、细胞分化程度的高低、有无淋巴结转移、3年生存率没有显著相关。结论: DNApolβ表达在肺癌的发生中起着重要的作用,该基因的表达低下可能是肺癌发生的一个分子标志。     

聚合酶链反应检测致病性钩端螺旋体微量DNA的研究

作者通过对黄疸出血群钩端螺旋体DNA的分子克隆和筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性构体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经DNA序列分析和限制性谱测定,分别合成两对聚合酶链反应寡核苷酸引物——引物B1、2和引物B3、4。以该引物对各群、型钩体微量DNA(0.1 ng)行聚合酶链扩增反应,引物B1、2能引导扩增全部致病性钩体DNA,引物B3、4则特异性地扩增黄疸出血群钩体DNA,非致病性钩体和其他微生物DNA均无扩增反应。结果表明,聚合酶链反应是一种灵敏度极高、针对性很强的DNA扩增技术,可用于钩体病早期诊断和流行病学分类鉴定。     

含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合酶链反应检测血清HBV DNA

为探讨含ｄＵＴＰ／尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶（ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）ＰＣＲ试剂（抗污染ＰＣＲ试剂，ＰＣＲ－ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）抗ＰＣＲ产物污染的能力及其在临床检测中的应用，采用该试剂检测２０４份病毒性肝炎患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，并与普通ＰＣＲ试剂比较。结果显示：抗污染ＰＣＲ试剂有较强的抗污染能力，至少可阻止１００ｎｇ的ＰＣＲ产物的污染。该试剂与地戈辛素探针分子杂交所测结果的符合率（８９．３２％）高于普通ＰＣＲ与分子杂交所测的符合率（８１．４５％）。表明抗污染ＰＣＲ试剂的应用有利于防止ＰＣＲ产物的污染，提高ＰＣＲ的准确性和特异性。     

DNA聚合酶β的研究现状

196 4年HillidayRA在其基因转换 (conversion)模型中提出了存在错配修复系统 (mismatchrepairsystem ,MRS)的假说 ,后分别于 1975年和 1983年通过遗传学分析及生化方法在大肠杆菌 (E .coli)中证实[1] ,以后又在几乎所有的原核及真核生物中得以证实。这些MRS能有效地修复几乎所有的碱基错配和小片短缺失或插入错配 ,通过消除DNA生物合成错误 ,增加了染色体复制的可信性 ,并在防止自由突变方面起着重要作用。 1970年Korhberg等[2 ]从原核细胞中发现并分离出了DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ ,后又在真核细胞中发现了DNA聚合酶α及EVR1。迄今为止在…     

Human DNA contains sequences homologous to the 5’-non-coding region of hepatitis C virus: characterization with restriction endonucleases reveals individual varieties

Objective To investigate a 272 base pair section of the 5‘-non-coding region of genomic DNA from the peripheral blood monounuclear cells of healthy hepatitis virus C (HCV)-negative human subjects( not patients).Mothods This sequence section bears interest because ① it harbors several potential methylation(Cp-rich) sites, and ② it represents the largest part of its internal ribosomal entry site. A pre-PCR digestion protocol was established making consistent use of four restriction endonucleases selected for certain features: Smal, XmaCI, Mspl, and Hpall are inhibited if methylation(s) are present at certain cytosines within their cutting sequences.Results The suspected HCV-specific sequence was found in the DNA of each subject tested. The pre-PCR digestion assay reveals individual differences in their pattern of methylation, which may be due to possible epigenetic phenomena.Conclusions The results provide formal proof that these HCV-specific sequences are contained in the genomic or extra chromosomal target DNA, and probably belong to a new class of endogenous sequences.     

结核杆菌DNA聚合酶链反应技术的应用

结核杆菌ＤＮＡ聚合酶链反应技术的应用李秀珍莫英曼（贵阳医学院附院肺内科贵阳５５０００４）结核病是长期以来危害人类健康的常见病，以往结核病的实验室检查依赖于涂片和培养，现在由于免疫学和分子生物学在医学领域中的应用，使结核病诊断的准确性有了很大程度的提高...     

应用聚合酶链反应标记高活性DNA探针

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)或称体外基因倍增技术,是一种在体外选择性地扩增特定DNA序列的新方法。它利用一对位于待扩增DNA序列两侧的取向相对的DNA引物,在DNA聚介酶的介导下,经过多次变性、退火和延伸过程的重复性循环,大量合成靶DNA序列。     

基因重组Taq DNA聚合酶的制备

目的制备重组Taq DNA聚合酶,为PCR提供试剂。方法用Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导12 h表达Taq DNA聚合酶,溶菌酶、NP40裂解细菌,硫酸铵沉淀、4℃透析,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和PCR扩增分析其纯度和活性。结果分离纯化制备的Taq酶,纯度、活性都可与同类产品相比,能有效扩增DNA片段。结论该方法制备可用于PCR的Taq酶具有快速简便的优点。     

霍乱弧菌染色体DNA限制性内切酶分析

目的 探讨冬季分离的霍乱弧菌与非冬季分离的霍乱弧菌在染色体基因组织构上的差异。染色体酶切位点的差异与菌株生物学性状及变异的关系。方法 采用10％SDS裂解细菌，酚和氯仿抽提染色体及纯化。分别用限制性内切酶BamHI、HindIII、EcoRI和PstI进行染色体DNA酶切。结果 冬季分离的与非冬季分离的霍乱弧菌标本染色体DNA经限制性内切酶酶切后酶切图谱基本一致。流行菌株与非流行菌株染色体DNA酶切图谱差异较大，酶谱明显不同。结论 冬季分离的霍乱弧菌标本与非冬季分离的霍乱弧菌标本生物学性状上的差异不能反映细菌染色体基因组上的差异。流行菌株与非流行菌株在细菌染色体基因结构组上存在明显的差异。     

以DNA测序及限制性酶切反应鉴定PCR产物特异性

目的：对ＰＣＲ产物进行特异性鉴定。方法：采用ＤＮＡ测序及限制性酶切反应方法。结果：ＤＮＡ测序可排除ＰＣＲ产物的假阳性，另一种简单易行的方法是，设计包含某一已知偏位性酶切位点的特异引物进行ＰＣＲ，通过酶切反应及电泳分析鉴定其特异性结论：此方法对ＰＣＲ产物特异性鉴定十分必要。     

乙型肝炎病毒感染DNA聚合酶的检测

应用氚标核苷酸标记被检者血清中HBVDNA聚合酶-P(DNA-P)活性,结果表明,此项检测比目前临床上肝炎病毒5项检测敏感,对乙型肝炎的临床诊断有重要意义。