4重荧光PCR技术在霍乱监测与菌株鉴定的应用研究

目的 应用4重荧光PCR技术检测霍乱弧菌并对菌株进行鉴定.方法 用PCR法对2008-2010年监测的水样、水产品标本及食物中毒疑似菌株以进行检测.同时用细菌学方法分离菌株.再进行PCR检测.结果 1606份标本中.PCR法检出O1群霍乱弧菌阳性标本188份.从中分离到菌株150份(79.8％).O139群霍乱弧菌的P...     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

进出口水产品中霍乱弧菌的检测与分析

目的监测并分析进出口水产品中的霍乱弧菌。方法采用传统两步增菌,平板划线,分离可疑单菌落,VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪、普通PCR、实时荧光定量PCR和血清凝集试验确认分离菌株。结果从水产品样品分离的菌株全自动微生物鉴定仪鉴定结果相似度达97%,普通PCR和实时荧光定量PCR检测为霍乱弧菌,ctx毒素基因检测为阴性,血清凝集试验为非O1非O139群霍乱弧菌。结论从水产品中检出霍乱弧菌非流行株,但仍需要加强主动监测,预防疫情的暴发。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

一起霍乱疫情的病原检测及药敏分析

【目的】对2018年浙江省海盐县一起霍乱疫情进行霍乱弧菌病原学检测及药敏分析,为霍乱防控工作提供参考。【方法】采集病例、密切接触者粪便样本和外环境、食品样本进行菌型鉴定和毒力基因检测,并对菌株进行临床常用的20种抗菌药物的药敏分析。【结果】本次疫情共采集1例病例及其密切接触者粪便样本101份、外环境样本35份、食品40份,总计176份样本。在1份病例的首次粪便样本中检出O139群霍乱弧菌,经实时荧光PCR法检测为毒素基因ctxA阳性,其余175份样本均未检出霍乱弧菌。药敏试验结果显示该菌株对喹诺酮类(诺氟沙星、左氟沙星、环丙沙星)、头孢类(头孢噻肟、头孢噻吩)、青霉素类(氨苄西林、阿莫西林)等多种抗生素敏感,对四环素、强力霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素、利福平耐药。【结论】本次霍乱疫情检出1株携带ctxA毒素基因的O139群霍乱弧菌,诺氟沙星、左氟沙星等抗生素可作为临床治疗与预防用药选择参考,该菌株出现多重耐药及耐药谱变化的现象需引起关注。     

2006年鸭绿江水及水产品中检出霍乱弧菌报告

〔目的〕通过对鸭绿江水及水产品中O1群和O139群霍乱弧菌检测,了解霍乱弧菌在其中的存活及菌型分布情况,为制定防治措施提供依据。〔方法〕采集鸭绿江水及水产品进行霍乱弧菌分离培养,血清学诊断符合O1群和O139群霍乱弧菌者,按国标法进行系统菌株鉴定。〔结果〕从216份(江水189份、水产品27份)标本中检出9株O1群霍乱弧菌,全部为江水中检出,总检出率为4.17%。其中稻叶型2株,占22.2%;小川型7株,占77.8%。〔结论〕检出的9株O1群霍乱弧菌均属非流行株,江水中霍乱弧菌的检出率高于水产品的检出率。总检出率较高,提示在今后霍乱监测中,鸭绿江水应继续作为重点。     

多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因

目的 探索建立一种快速、敏感地检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1／非O139群的毒素相关基因的方法。方法 针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(oce)、霍乱弧菌毒素共调菌毛A基因(tcpA)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)分别设计引物，建立多基因PCR方法；通过一次扩增反应之产物经琼脂糖凝胶电泳，可检测出菌株的毒素相关基因的携带情况。结果 阳性对照菌株：MO45(霍乱弧菌O139群)检出5种毒素相关基因，结果符合设计要求；其他不同来源的霍乱弧菌(O1群、O139群、非O1／非O139群)检出1—5种不等的毒素相关基因；根据毒素相关基因携带情况，可将菌株分为5个基因型，并可区分为产毒株和非产毒株；多重PCR敏感度可达10^2cfu／ml。结论 该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

下城区健康人群粪便中检出O1和O139群霍乱弧菌毒力株和无毒力株

目的：对下城区饮食、服务行业人员粪便标本进行霍乱弧菌监测。方法：2007年1月-2007年9月采集25052名饮食、服务行业从业人员健康体检者粪便标本,分别接种于碱性蛋白胨水增菌后分离4号琼脂。通过培养特性、菌落形态、革兰染色、动力和生化试验等检查,对所分离的疑似霍乱弧菌菌株进行初步鉴定,采用霍乱弧菌O1群及O139群单克隆抗体的玻片凝集试验、噬菌体生物分型、霍乱弧菌ctxA和tcpA基因PCR检测进一步鉴定各霍乱菌株。结果：上述标本中检出O1血清群和O139血清群霍乱弧菌各1株。1株O1血清群霍乱弧菌噬菌体生物分型为1 L,属埃尔托生物型非流行菌株,霍乱弧菌ctxA和tcpA毒力基因PCR检测结果为ctxA阴性,tcpA阳性,判定为有毒力的非流行菌株。另1株O139血清群霍乱弧菌ctxA和tcpA基因PCR检测结果均为阴性,为无毒力非流行菌株。结论：尽管所检出的2株霍乱弧菌均为非流行菌株,但因携带者从事职业的特殊性,仍应引起高度重视。     

2003～2007年厦门市海沧区外环境中霍乱弧菌监测结果分析

[目的]了解水体和水产品霍乱弧菌污染情况。[方法]2003～2007年,厦门市海沧区5～10月采集水产品和水体,检测O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌。[结果]5年合计,从922份水体中检出3株霍乱弧菌,从1040份水产品中检出6株霍乱弧菌。9株霍乱弧菌均为O1群,其中小川型4株、稻叶型5株,均为霍乱弧菌肠毒素CT阴性的无毒株。[结论]厦门市海沧区外环境中的霍乱弧菌主要是O1群非流行株。     

子代T4的PCR和real time PCR测定

目的：为建立通过测定转换样品T4而检验样品大肠杆菌的新方法,探讨快速测定转换样品中T4的PCR技术.方法：以T4DNA纯化样品水稀释液和转换样品沸水浴处理产物分别为模板样液,经过两对引物PCR及real time PCR的试用和比较,优选定量检测转换样品中T4的适宜方法和条件.结果：源自T4 ligase的一对引物具有较高的灵敏度和特异性;针对纯化T4DNA配制的模板样液,优化的PCR和real time PCR至少可分别精确检出39.25和3.925 pg/ml的T4DNA;针对沸水浴处理转换样品制备的模板样液,PCR和real time PCR可清楚区别不同浓度的转换样品,PCR的检出极限为500 PFU/ml T4的转换样品,real time PCR的检测极限为35 PFU/ml T4的转换样品.结论：采用PCR和real time PCR可快速定量测定转换样品中的T4含量,real time PCR比PCR的灵敏度高约一个数量级.     

应用特异性引物鉴定红色毛癣菌

目的探讨建立一种快速、简单可重复的鉴定红色毛癣菌的方法. 方法利用特异性引物TR1F和TR1R对32株皮肤癣菌进行PCR扩增. 结果红色毛癣菌和苏丹毛癣菌产生特征性带型,而其他皮肤癣菌为阴性. 结论这种PCR方法可以快速、准确、敏感地鉴定红色毛癣菌.     

短串联重复序列PCR及其应用

STR（short tandem repeat）基因座广泛分布于各种真核生物基因组中，是高度多态性标记的丰富来源，并可用PCR反应来检测。扩增区域重复序列熏复次数的差异导致STR基因座的等位基因不同的分型，可区别不同的基因型。本文介绍了短串联重复序列PCR的基本原理和分析方法，并简要介绍了短串联重复序列PCR在亲缘关系鉴定、种群遗传结构分析、基因图谱以及基因诊断等方面的应用。     

PCR快速检测奇异变形杆菌的研究

目的 建立一种检测奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)快速且特异的PCR方法. 方法 针对编码奇异变形杆菌脲酶调节子(ureR)的基因序列设计2条PCR引物,扩增片段长度为225 bp;通过对2株奇异变形杆菌和14株非奇异变形杆菌进行PCR检测、利用该PCR方法和传统分离培养法同时对60份食物中毒送检标本进行检测来评价其特异性;将奇异变形杆菌菌液做一系列10倍稀释后进行PCR检测来对其进行敏感性分析. 结果 2株奇异变形杆菌出现PCR扩增反应,扩增产物经测序鉴定正确,14株非奇异变形杆菌没有出现PCR扩增反应,且PCR检测奇异变形杆菌的结果与传统培养方法一致,PCR方法相比传统培养方法更快速,在4 h内即可完成扩增反应;PCR方法敏感性为30 cfu/ml.结论 建立了一种快速,准确检测奇异变形杆菌的PCR方法,适合奇异变形杆菌日常监测和快速诊断的需要.     

PCR法在早期梅毒诊断中的应用

目的提高早期梅毒诊断的敏感性和特异性。方法采用PCR技术对梅毒螺旋体（Tp）的DNA多聚酶Ⅰ基因（polA）特异性片段进行扩增,共检测385份生殖器溃疡分泌物,同时做暗视野镜检和TpELISA血清学试验。结果 PCR法共检测出阳性75例,敏感性和特异性分别为74.5%、99.3%;PCR法与暗视野镜检及TpELISA结果比较差异有统计学意义。结论 PCR法在早期梅毒诊断中具有快速、有效、结果可靠的优点,可作为血清学的补充试验。     

应用PCR技术快速检测沙门菌

[目的]建立用于快速和特异检测沙门菌的PCR方法。[方法]将受试菌种按煮沸裂解法提取DNA,针对hns与invA基因序列合成2对PCR引物,对沙门菌标准菌株和其他菌属的菌株进行PCR检测,并用福建省2006—2007年沙门菌临床分离株137株进行验证。[结果]沙门菌标准菌株hns和invA基因均为阳性;137株沙门菌临床分离株hns和invA基因的阳性率分别为100％和99．3％,其他菌属的菌株无特异性条带。[结论]本研究建立的PCR方法可用于检测沙门菌属。     

PCR在钩端螺旋体病诊断和流行病学上的应用

钩端螺旋体病足具有强传染性的人兽共患病,其临床症状多变,容易与其他感染性疾病混淆,快速准确地诊断钩端螺旋体病及进行有效的流行病学调查十分重要.PCR具有特异性强、自动化程度高、快速高效等优点,在钩端螺旋体病的早期诊断和流行病学调查上具有很好的应用前景.     

PCR法快速鉴定啤酒中分离的乳酸杆菌

目的：建立一种灵敏、快速的PCR法检测啤酒中的乳酸杆菌。方法：设计一对属特异性引物扩增乳酸杆菌的16SrDNA基因，对7株乳酸杆菌进行检测，扩增片断长度为223bp，金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、李斯特菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、铜绿假单孢菌5种菌作为阴性对照菌。结果：该引物能扩增7株乳酸杆菌，结果为阳性；阴性对照菌结果为阴性。结论：该方法快速、灵敏、特异。为啤酒中乳酸杆菌的快速检测提供了有效的途径。     

PCR法检测胰蛋白酶中的猪细小病毒

目的建立原材料胰蛋白酶中猪细小病毒的PCR检测方法。方法提取病毒DNA,PCR扩增目标片段,扩增片段位于猪细小病毒的VP2区,对PCR敏感性进行试验,并应用于原材料胰蛋白酶中的猪细小病毒检测。结果扩增产物在预期位置出现条带,敏感性能检测到100TCID50的病毒量。胰蛋白酶对猪细小病毒检测的灵敏度无抑制作用;3批胰蛋白酶中的猪细小病毒检测结果均为阴性。结论本方法具有良好的敏感性,可用于原材料胰蛋白酶中的猪细小病毒检测。     

PCR检测粪便中志贺菌

目的 建立一种粪便样本中快速、特异、敏感的志贺菌检测方法 .方法 运用PCR对痢疾、福氏、鲍氏和宋内4群志贺菌进行侵袭性质粒H抗原(ipaH)基因的检测,并对该PCR方法 进行反应的灵敏度、特异性以及模拟粪便样品的最低检出限测定.结果 4群志贺菌均能检出侵袭性质粒H抗原(ipaH)基因,纯菌检测灵敏度达102cfu/ml,特异性实验中志贺菌菌株PCR扩增均为阳性,阴性对照菌株未扩增出特异性条带,混合菌株PCR扩增均为阳性;接种志贺菌到粪便样品中,当粪便样本中菌量达104 cfu/ml以上时,不需要增菌,志贺菌均可立即检出.结论 PCR方法 检测志贺菌灵敏度高、快速、特异性强,可以很好地应用于粪便等临床样本中志贺菌的检测与鉴定.