人白细胞介素—15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞？…

目的 观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达,方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ构建ＰＬ－ＩＬ－１５－ＳＭ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果 获得３个ＰＧ     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７,得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ,然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。     

人IL—4重组逆转录病毒载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达

利用多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法，从ＰＣＤ－ｈＩＬ－４质粒中扩增得到人白细胞介素４（ｈＩＬ－４）的ｃＤＮＡ－。ＤＮＡ序列测定证实此片段包含完整的ＩＬ－４开放阅读框架。应用ＤＮＡ重组技术，将此ｃＤＮＡ重组于逆转录病毒载休ＬＸＳＮ。用脂质体转染法将此重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７。得到滴度为２．５ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ的感染性病毒。病毒感染人白血病细胞株ＨＬ－６０、Ｋ５６２及Ｂｕｒｋｉｔ淋巴瘤细胞株Ｒａｊｉ，使之表达并分泌ＩＬ－４。逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法证实ｈＩＬ－４ｃＵＮＡ可在上述肿瘤细胞中持续转录。ＥＬＩＳＡ怯证实病肿瘤细胞分辨ＩＬ一４水平可高达３００Ｐ／１０细胞．２４小时。本研究为进一步探讨转ＩＬ一４基因用于血液系统恶性肿瘤免疫治疗的价值提供了基础。     

TIMP—1基因转染对人肺巨细胞癌细胞系生物学行为的影响

利用基因重组技术构建了一个含有全长人ＴＩＭＰ－１ｃＤＮＡ的真核表达重组体。重组质粒通过脂质体法导入高转移人肺巨细胞癌细胞系（ＰＧ细胞）。随机挑选Ｇ４１８抗性克隆，并对其中的两个克隆ＰＧ－Ｔ２和ＰＧ－Ｔ４进行了深入的研究。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹表明，，这两个克隆具有较高的ＴＩＭＰ－１ＲＮＡ表达，其表达水平明显高于ＰＧ细胞和空载体转染对照细胞ＰＧ－ＭＶ，ＰＧ－Ｔ２和ＰＧ－Ｔ４克隆细胞显示出很高的ＴＩＭＰ     

抑癌基因nm23-H1对化疗药物增敏作用的体外实验研究

目的：探讨抑癌基因nm23-H1对几种常用化疗药物的增敏作用。方法：构建含有人全长的nm23-H1基因cDNA的真核表达载体质粒pcDNA3-nm23-H1，通过脂质体介导，将它和空载体质粒pcDNA3分别转染鼠肺腺癌LA-795细胞株中，得到的阳性转染子分别命名为pcDNA3-nm23-H1-795细胞，pcDNA3-795细胞，另设795细胞为正常对照组，用MTT法测定nm23-H1对顺铂，氮芥，丝裂霉素C，5-氟尿嘧啶，长春新碱和足叶乙苷的增敏效应。结果：nm23-H1基因在pcDNA3-nm23-H1-795细胞中获得了表达，MTT法检测nm23-H1对顺铂，氮芥，丝裂霉素C有不同程度的增敏作用，而对5-氟尿嘧啶，长春新碱和足叶乙苷没有此效应。结论：nm23-H1可增加化疗药物顺铂，氮芥，丝裂霉素C对LA-795细胞的敏感作用。     

Effect of interleukin-6 on the growth of human lung cancer cell line.

Ｅｆｅｃｔｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６ｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｈｕｍａｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｅＦｕＪｉａｎ付坚，ＺｈｅｎｇＪｉｅ郑杰，ＦａｎｇＷｅｉｇａｎｇ方伟岗ａｎｄＷｕＢｉｎｇｑｕａｎ吴秉铨ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇ...     

THE INTERRELATIONSHIP BETWEEN TUMOR CELLS＇ ELECTROPHORETIC MOBILITY，ADHESIVE AND INVASIVE ABILITIES，AND THEIR METASTATIC POTE

ＴＨＥＩＮＴＥＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳＨＩＰＢＥＴＷＥＥＮＴＵＭＯＲＣＥＬＬＳ＇ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＴＩＣＭＯＢＩＬＩＴＹ，ＡＤＨＥＳＩＶＥＡＮＤＩＮＶＡＳＩＶＥＡＢＩＬＩＴＩＥＳ，ＡＮＤＴＨＥＩＲＭＥＴＡＳＴＡＴＩＣＰＯＴＥＮＴＩＡＬＧａｏＪｉｎ（...     

谷胱甘肽巯基转移酶pi参与肿瘤细胞耐药性的产生

目的建立携带大鼠谷胱甘肽巯基转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）ＣＤＮＡ的细胞表达体系。方法用磷酸钙沉淀法将重组质粒ｐＳＶ－ＧＴ和载体质粒ｐＳＶ－ｎｅｏ分别转染ＨｅＬａ细胞,Ｇ４１８筛选得两株转染阳性细胞ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ和ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ;采用细胞原位杂交法,以地高辛标记的ＧＳＴ－ｐｉ　ｃＤＮＡ为探针,检测两细胞株ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的表达水平;用ＭＴＴ法检测不同抗癌药物对细胞株的毒性作用。结果ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ表达明显升高,而ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ和ＨｅＬａ细胞的表达水平很低。阿霉素、丝裂霉素Ｃ和顺铂对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＩＣ５０分别为７０．１３、１０．９５和１６．５２ｕｇ／ｍｌ,对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ的ＩＣ５０分别为１０．３４、７．４８和１３．７０ｕｇ／ｍｌ,长春新碱对两细胞株的毒性无明显差别。结论ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ细胞具有较高的耐药性。ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的大量表达可能是产生多药耐药的原因,此细胞株可作为一个稳定的遗传学系统在ＧＳＴ－ｐｉ与肿瘤细胞耐药的研究中广泛应用。     

Molecular mechanism for effects of NM23-H1 on primary hepatocellular carcinoma with intrahepatic metastasis

Themostlife--threateningaspectsoftheoncogenicprocessareinvasionandmetastasis.Eventhoughtheclinicalsignificanceofsuchexpressionofthemalignantphenotypehasbeenwellappreciated,advancesinunderstandingthemolecularmechanisminvolvedinmetastasishavelaggedbehind.Therecurrenceofprimaryhepatocellularcarcinoma(HCC)isusuallycausedbytheintrahepaticmetastasisthroughtheportalvein[1.2J.TheNM23--HIgene,aputativemetastasissuppresser,wasoriginallyrevealedinmurinemelanomacelllines.Subsequently,theNM23-HImRNAw…     

IL—4基因修饰对HL—60及其诱导人PBMC增殖反应的影响

为探讨人白细胞介素４（ｈＩＬ－４）ｃＤＮＡ修饰对人髓系白血病株ＨＬ－６０细胞体外生物学特性的影响，构建了ｈＩＬ－４重组逆录病毒载全。用脂质体转染法将其导入包装细胞获高效价病毒上清，用其感染ＨＬ－６０细胞株并筛竿了ＨＩＬ－４高表达克克隆５株，用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测其增殖反应及其讫地的正常人ＰＢＭＣ增殖反应。结果显示，ＩＬ－４同表达克隆体外增殖反应明显强于低表达克隆；丝裂线素处理后，前者诱导的正常     

反义血管内皮细胞生长因子基因转染在调节人肺巨细胞癌血管生成及肿瘤生长和转移中的作用

目的　探讨反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因转染在减少肿瘤细胞内源性血管内皮细胞生长因子分泌 ,调节肿瘤血管生成和肿瘤生长转移中的作用。方法　利用脂质体法将反义基因转染到高转移性人肺癌细胞 (PG) ,以转基因肿瘤细胞培养上清刺激人脐静脉内皮细胞 ,进行噻唑蓝 (MTT)和3H胸腺嘧啶 (3HTdR)掺入实验 ;并将转基因肿瘤细胞接种于裸鼠体内 ,应用免疫组织化学法检测肿瘤内微血管密度 (MVD) ,探讨MVD与肿瘤生长转移的关系。结果　反义VEGF基因的转染 ,使肿瘤细胞VEGF分泌减少 ,其培养上清刺激人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)生长活性较空载体组减弱 ,HUVEC之DNA合成减少 ,裸鼠移植瘤内MVD为 41个± 9个 ,空载体组为 5 8个± 10个 ,两组比较t=2 715 ,P <0 .0 5。结论　反义VEGF基因的转染使肿瘤细胞分泌VEGF能力下降 ,肿瘤血管生成能力降低 ,这在肿瘤的生长和转移调节中有重要意义。     

反义血管内皮细胞生长因子基因转染在调节人肺巨细胞癌血管生成及肿瘤生长

OBJECTIVE: To study the regulatory effect of antisense VEGF121 cDNA transfection on endogenous VEGF secretion and angiogenesis of human metastatic lung carcinoma cell line PG and explore the significance of microvessel density (MVD) in tumor growth and metastasis. METHODS: The eukaryotic expression vectors bearing antisense VEGF121 cDNA was transfected into PG cells. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were cultured in conditioned mediums from transfected cells, and proliferation was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and 3H thymidine incorporation (3H TdR) assays in vitro. Microvessel density (MVD) in xenografted tumors in nude mice was analyzed by immunohistochemistry. RESULTS: The transfectant of antisense VEGF121 cDNA exhibited a reduction in VEGF secretion. HUVEC grown in conditioned medium from the antisense VEGF transfected cells exhibited a decrease in capacities of DNA syntheses and cell proliferation. MVD of tumor with transfected antisense VEGF gene was significantly lower than that in control vector. CONCLUSION: Antisense VEGF gene transfection can inhibit vascular endothelial cell proliferation in vitro and tumor angiogenesis in vivo, which may explain its inhibitory effects on tumor growth and metastasis.     

Expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in HepG2 cell line

AlthoughthegenomeofseveralstrainsofhepatitisCvirus(HCV)havebeenclonedandscquenced,theHCVparticleshavenotbeenobservedsofar.Currently,becauseofverylowInfectionefficiency,oneofthemajorimpedimentstothestructuralanalysisofHCVgenomeandgeneticanalysisofviralreplicationisthelackofareliablecellculturesystempermissiveforH(IVreplicanon.Inthisstudy,usingrecomblnantDNAtechnlque,weconstructedarecombinantplasmidbysubcloningcoregenecDNAofChineseH(7VisolateIntoaeukaryoticexpressionvectorPTM3andexpres…