NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的：对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白(neutrophil gelatlnase-associated lipocalin。NGAL)基因5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法：以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因5′侧翼区(-1431～ 84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果：在NGAL基因5′端-945～-658和-657～-4172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用，而在-416～-152区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论：在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着2个转录增强子元件和1个转录沉默子元件。     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和 1个转录沉默子元件     

NGAL 基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定

 目的 对NGAL(neutrophil gelatimse-associated lipocalin)基因5’侧翼区的转录调控启动子区进行分段定位鉴定。方法 将NGAL基因5’侧翼区-416～+84和-152～+84两个区段分别克隆至专门用于研究启动子的报告基因表达载体pGL3-Enhancer(pGLE)中，构建表达载体pGLE-416和pGLE-152；然后将pGLE-152和pGLE-416分别与pRL-TK载体共转染HeLa细胞、EC109细胞和Vero细胞，通过检测相对荧光素酶活力，确认这些NGAL基因片段中是否含有启动子元件。结果 与pGLE相比，pGLE-152在上述三种细胞中的相对荧光强度均明显增强(P<0．05)，且在不同的细胞中增强的幅度明显不同。结论 NGAL基因的启动子位于-152～+84区段内，启动子的强弱具有细胞特异性，这可能与增强子的协同作用相关联。     

NGAL 基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定

目的对NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因5′侧翼区的转录调控启动子区进行分段定位鉴定.方法将NGAL基因5'侧翼区-416～ 84和-152～ 84两个区段分别克隆至专门用于研究启动子的报告基因表达载体pGL3-Enhancer(pGLE)中,构建表达载体pGLE -416和pGLE -152; 然后将pGLE -152和pGLE -416分别与pRL-TK载体共转染HeLa细胞、EC109细胞和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有启动子元件.结果与pGLE相比,pGLE -152在上述三种细胞中的相对荧光强度均明显增强(P<0.05),且在不同的细胞中增强的幅度明显不同.结论 NGAL基因的启动子位于-152～ 84区段内,启动子的强弱具有细胞特异性,这可能与增强子的协同作用相关联.     

NGAL基因3''''端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的将不同长度的NGAL基因3'端序列(包括外显子、内含子和部分3'侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素酶活力,确认NGAL 3'端序列中是否含有增强子或抑制子元件.方法应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1 880 bp)和F7(826 bp),将其克隆到pGEM-T easy载体,并测序验证;再亚克隆到pGL3-Promoter载体中,获得pGLP-F5和pGLP-F7表达载体;将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件.结果我们成功构建了pGLP-F5和pGLP-F7重组载体.Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比,酶活力未表现出明显的增强或减弱.结论在本研究的实验条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不明显.     

NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的：将不同长度的NGAL基因3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中，通过检测报告基因荧光素酶活力，确认NGAL3′端序列中是否含有增强子或抑制子元件。方法：应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1880bD)和F7(826bp)，将其克隆到pGEM-T easy载体，并测序验证；再亚克隆到pGL3-Pro-moter载体中，获得pGLP-F5和pGLP-F7表迭栽体；将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞，通过检测相对荧光素酶活力，确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件。结果：我们成功构建了pGLP-F5和pGLPF7重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比，酶活力未表现出明显的增强或减弱。结论：在本研究的实验条件下，NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用，或作用不明显。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5’端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的：从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5’端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法：采用PCR法克隆NGAL基因5’端转录调控区，并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果：从SHEEC中获得了NGAL基因5’端转录调控区-1124— 65区段的克隆，该区段序列有3处点突变，在NGAL基因-1124— 65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点。结论：多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素。     

NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的:将不同长度的NGAL基因 3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧 翼非翻译序列)克隆到pGL3 Promote (pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素 酶活力,确认NGAL3′端序列中是否含有增 强子或抑制子元件。方法:应用PCR技术 从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同 长度的NGAL基因片段F5(1880bp)和F (826bp),将其克隆到pGEM Teasy载体 并测序验证;再亚克隆到pGL3 Promoter载 体中,获得pGLP F5和pGLP F7表达载体 将pGLP F5和pGLP F7载体分别与pRL TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞 通过检测相对荧光素酶活力,确认这些 NGAL基因片段中是否含有增强子元件 结果:我们成功构建了pGLP F5和pGLP F 重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞 与pGL3 Promoter相比,酶活力未表现出明 显的增强或减弱。结论:在本研究的实验 条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的 顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不 明显。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的 :从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因 5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法 :采用PCR法克隆NGAL基因 5′端转录调控区 ,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果 :从SHEEC中获得了NGAL基因 5′端转录调控区 - 112 4～ +6 5区段的克隆 ,该区段序列有 3处点突变 ,在NGAL基因- 112 4～ +6 5区段共鉴定出 78个有效顺式作用元件位点。结论 :多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素     

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

 目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。     

食管癌细胞NGAL 基因-416～+84 区段存在TPA 反应元件

 目的 本文旨在对NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件进行研究。方法 （1）采用PCR法从食管癌细胞中克隆NGAL基因5’侧翼区-416-＋84片段，然后分别插入质粒pGLB和pGLE，构建pGLB-416和pGLE-416荧光素酶报告基因表达栽体；（2）将pGLB-416和pGLE-416分别同pRL—TK共转染食管癌细胞EC109；（3）用TPA刺激转染的EC109，检测细胞相对荧光素酶活力，通过相对荧光素酶活力变化判定NGAL基因5’侧翼-416～＋84区是否存在TPA反应元件，同时进行生物信息学分析。结果 无论是pGLB-416还是pGLE-416，与pRL-TK共转染食管癌细胞EC109后，用TPA刺激，与其相应的空载体相比，转染细胞荧光素酶活力均极显著升高（t检验，P〈0．01），约分别升高46．82和46．41倍；而TPA刺激组与没有TPA刺激组相比，pGLB-416和pGLE-416转染EC109细胞荧光素酶活力分别显著升高了5．17倍和7．37倍（t检验，P〈0．01）。生物信息学分析显示，NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段至少存在4个潜在的TPA反应元件。结论 食管癌细胞NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段存在着TPA反应元件。     

NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的 :克隆NGAL基因的cDNA ,并构建其表达载体。方法 :应用RT PCR技术 ,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)基因的cDNA ,并重组到中间载体pT Adv中 ,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA 3和原核表达载体pGEX 4T 3中。结果 :获得了NGAL基因的cDNA全序列 ,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA NGAL( - )和原核表达载体pGEX NGAL ,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论 :为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体 ,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

Construction and Expression of an Eukaryotic Expression Vector Containing the IER3 Gene

Background: More and more research indicate that the immediately early response gene 3 (IER3) is involvedinmany biological provesses, such as apoptosis and immunoreaction, as well as viral infection, tumorigenesisand tumour progression. Methods: Here we describe the construction of an eukaryotic expression vectorcontaining IER3 gene and its expression in A549 cells as assessed through fluorescence microscopyand Westernblotting.Results: Fluorescence detection displayed that GFP in cytoplasm was high during 48 and 72 hourspost-transfection. In addition, Western blotting showed significant increase in IER3 gene expression in thetransfected cells compared with controls. Conclusion: The recombinate plasmid expression vector was constructedsuccessfully, which may provide a basis for further exploration of function of IER3 in lung cancer.     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

pVAX-iNOS真核表达载体的构建及其抗肺癌作用研究

背景与目的 iNOS与NO介导的抗肿瘤效应有关.本研究旨在构建pVAX-iNOS载体并转染A549肺癌细胞,检测其基因的表达并初步探讨iNOS基因表达增高后对A549肺癌细胞的抗肿瘤作用.方法 应用RT-PCR方法扩增人iNOS编码序列的CDS片段,构建pVAX-iNOS载体后转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达;采用MTT法、Hoechst 3235染色和划痕实验分别检测iNOS高表达在体外对肺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移作用的影响.结果 真核表达质粒载体pVAX-iNOS构建成功,iNOS蛋白在转染后的A549细胞中表达升高.pVAX-iNOS转染A549肺癌细胞后能明显诱导细胞发生凋亡并抑制肿瘤细胞的生长和迁移.结论 本研究成功构建pVAX-iNOS真核表达质粒,高表达iNOS能明显抑制A549细胞的增殖、迁移并促进细胞发生凋亡.本研究有望为临床治疗肺癌提供一个新的有效策略.     

A model to account for the effects of oncogenes,TPA, and retinoic acid on the regulation of genes involved in metastasis

We have postulated that signals from the microenvironment can induce shifts in tumor cell phenotypes and that microenvironmental factors are therefore important for cancer metastasis [1]. In this article we expand on this hypothesis and propose a model to explain (a) how extracellular signals can lead to changes in tumor phenotypes, and (b) how cytoplasmic oncogenes, which influence signal transducing pathways as well as nuclear oncogenes regulating gene expression via DNA binding transacting factors, might affect metastatic competence.