广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA表达文库中优势诊断抗原的筛选、鉴定和克隆

目的 筛选与广州管圆线虫感染小鼠血清具有较强免疫反应性的优势诊断抗原.方法 用感染广州管圆线虫21 d的小鼠感染血清做免疫探针筛选广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA表达文库,对筛选得到的阳性克隆进行插入片段的测序和生物信息学分析,再根据测序结果设计引物扩增该基因并将其克隆入PET-30a(+)载体中.结果 共获得6个阳性克隆,经DNA测序及同源性分析表明,发现其中2个与广州管圆线虫髓鞘转录因子1(MYTl)高度同源,1个与广州管圆线虫胶原蛋白家族基因(alpha-collagen)高度同源,且均为全长cDNA.克隆出广州管圆线虫MYT1全长cDNA序列,构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符合的目的片段.结论 用感染小鼠血清作为探针初步筛选到2个广州管圆线虫基因,并成功构建MYT1的原核表达重组质粒PET30a(+)-MYT1.     

广州管圆线虫一期幼虫的分离纯化及其抗原分析

目的建立广州管圆线虫一期幼虫的分离纯化方法,分析其抗原特性及血清学诊断价值。方法分别用贝尔曼漏斗法、蔗糖离心浮选法及改良贝尔曼法联合胰酶消化法从大鼠粪便中分离纯化一期幼虫;用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白谱与抗原谱分析;分别用一期幼虫和成虫抗原包被ELISA反应板,间接法检测不同样本中相应抗体。结果3种方法分离效率分别为50.1%、33.6%和19.7%;联合法获得的纯度最高,且90%以上的幼虫有活力;贝尔曼漏斗法分离的幼虫99%以上具有活力但纯度低;蔗糖离心浮选法分离的绝大多数虫体失去活力。一期幼虫104000Mr与广州管圆线虫感染2周的大鼠血清出现强反应,32000Mr和31000Mr与感染6周的大鼠血清、32000Mr与广州管圆线虫病患者血清均出现较强反应,与对照血清均未出现明显的反应;在ELISA检测中,一期幼虫抗原对广州管圆线虫病患者血清和感染大鼠血清的检出率与成虫抗原无统计学差异。结论改良贝尔曼法联合胰酶消化法可从大鼠的粪便中分离高纯度且具有活力的一期幼虫,一期幼虫104000Mr、32000Mr和31000Mr具有潜在的诊断价值,可望从大鼠粪便中分离一期幼虫开发诊断性抗原。     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

各种化学因素对广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫活力的影响

目的寻找更为简便、有效的杀灭蔬菜和水中广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫的方法,防止因生食蔬菜或凉拌菜而感染广州管圆线虫病,另外也为寻找新的治疗广州管圆线虫病药物进行前期研究。方法将广州管园线虫第三期幼虫置于各种不同浓度的化学试剂溶液中,镜下观察虫体的活动能力和形态的改变。结果用于消毒餐具1∶80稀释后有效氯终浓度为5.9%的次氯酸钠消毒液1.5 h可使幼虫完全停止活动;用于饮用水消毒的有效氯终浓度为0.35‰的消毒片使虫体运动加快,4 h后仍非常活跃;10%酱油处理10 min即可使幼虫活动明显减弱,30 min虫体完全死亡,虫体卷曲,出现空泡,而且酱油加热后杀虫效果有所增加。结论次氯酸钠消毒液1∶80稀释后用于浸泡餐具、蔬菜或喷洒地面,可用于预防广州管圆线虫病;在食用螺类或凉拌菜时加入酱油可起到预防广州管圆线虫病的作用;酱油加热后杀虫效果并不丧失,表明具有杀虫作用的是一种非蛋白质的化学物质,该物质具有成为新的治疗广州管圆线虫病药物的可能。     

广州及其周边地区福寿螺体内广州管圆线虫感染的现状调查

目的了解广州及其周边地区福寿螺感染广州管圆线虫的情况,为防治提供依据。方法．人式消化174只福寿螺。显微镜下检查消化液中有无广州管圆线虫幼虫。结果广东省广州市花都区、广州市越秀区、兴宁、化州、蕉岭、茂名等六地的福寿螺感染率分别为25．0％、23．1％、24．2％、18．5％、14．3％、13．3％,广东省东莞采集的福寿螺未发现感染广州管圆线虫。结论广东省广州市花都区、广州市越秀区、兴宁、化州、蕉岭、茂名等六地存在广州管圆线虫的自然疫源地。     

无机盐及葡萄糖对广州管圆线虫三期幼虫的体外趋化作用

目的观察不同浓度的无机盐及葡萄糖对广州管圆线虫三期幼虫（AC-L3）的趋化作用。方法将含有20、50、100和150mmol/L无机盐（KCl、NaCl、Na2HPO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2）及葡萄糖溶液的纸片与蒸馏水浸泡的纸片分别贴于琼脂糖平皿的两个区域（实验区和对照区）,将活力好的AC-L3离心后重悬,释放于平皿中央,避光孵化8h,显微镜下计数各区域幼虫。结果 20mmol/L Na2HPO4（P=0.016,CI=0.587）和50mmol/L NaCl（P=0.025,CI=0.696）对AC-L3有较明显的趋向作用,而100mmol/L KCl（P=0.027,CI=-0.546）和150mmol/L NaCl（P=0.028,CI=-0.366）对AC-L3有趋避作用。20mmol/L KCl、NaHCO3、MgCl2,100mmol/L CaCl2,150mmol/L NaHCO3、MgCl2均对AC-L3有趋向作用,但CI值均在0.5以下。不同浓度的葡萄糖对AC-L3的趋化作用差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 NaCl、NaHPO、KCl等无机盐对AC-L3具有一定的趋化作用,并且与无机盐的浓度相关。     

广州管圆线虫幼虫排泄分泌抗原及其诊断价值分析

目的对比分析广州管圆线虫幼虫排泄分泌抗原(LESA)与成虫抗原(AWA),探讨其诊断价值。方法广州管圆线虫三期幼虫感染小鼠,21 d后取小鼠脑内幼虫进行体外培养,收集幼虫排泄分泌蛋白,并与广州管圆线虫成虫匀浆蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析,分别用两种抗原建立LESA-ELISA和AWA-ELISA以检测小鼠血清和不同人群血清。结果SDS-PAGE和Western blot显示幼虫排泄分泌蛋白条带和抗原反应带较成虫少;LESA与小鼠感染血清和广州管圆线虫病患者血清在Mr40 000和Mr26 000处均出现强反应带;感染小鼠血清中抗LESA和AWA的IgG和IgM抗体自感染后开始上升,5 d后达到高峰,第10天后开始下降;LESA-ELISA用于检测广州管圆线虫病疑似病人血清阳性率低于AWA-ELISA;检测血吸虫和华支睾吸虫感染病人血清的交叉阳性率明显低于AWA-ELISA;检测献血员血清及其他非广州管圆线虫感染血清时,假阳性数较AWA-ELISA少。结论 LESA的抗原反应带较AWA少,尽管对广州管圆线虫病疑似病例血清抗体阳性率略低于AWA,但其特异性高;具有潜在的广州管圆线虫病早期诊断和现症感染诊断价值。     

不同温度对广州管圆线虫感染期幼虫的杀灭作用

目的 探究广州管圆线虫感染期幼虫(第Ⅲ期幼虫)在不同温度不同时间下的生存及死亡情况(死亡率).方法 采用人工消化法,从自然感染的褐云玛瑙螺中提取广州管圆线虫感染期幼虫,将其放入不同温度(35～90℃)的热水中,分别作用不同时间(1～20 min).取出置解剖镜下观察虫体的变化情况.结果 在1～20 min内,45℃以下温度对感染期幼虫不具有杀灭作用,死亡率为0;50～55℃温度对感染期幼虫有轻度的杀灭作用,死亡率为12.00%～97.33%;60～65℃温度对感染期幼虫有一定强度的杀灭作用,死亡率为57.39%～100.00%:70～75℃温度对感染期幼虫有很强的杀灭作用,死亡率为97.22%～100.00%;在80℃以上温度时感染期幼虫迅速死亡,死亡率为100.00%.结论 45℃以下温度,20 min内对广州管圆线虫感染期幼虫没有杀灭作用;50～75℃温度,1～20 min,对大多数广州管圆线虫感染期幼虫具有杀灭作用,温度越高,时间越长,杀灭作用越强:80℃以上温度,1～20 min,对广州管圆线虫感染期幼虫具有完全杀灭作用.     

广州管圆线虫Ⅰ期幼虫感染河蚬、河蚌实验研究

目的了解广州管圆线虫Ⅰ期幼虫是否感染河蚬、河蚌,为研究广州管圆线虫病提供科学依据。方法从广州管圆线虫疫区龙海市海澄镇采集广州管圆线虫中间宿主褐云玛瑙螺,解剖分离Ⅲ期幼虫。大白鼠共12只,分3组,每组4只,经口感染大白鼠,每组分别感染100、50和25条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫/只,40 d后采集鼠粪镜检,确认感染成功。将鼠笼置于实验感染池上方,以鼠粪便内广州管圆线虫Ⅰ期幼虫感染河蚬、河蚌。结果感染第14 d解剖河蚌和河蚬,均检出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,感染第28 d镜检,两者感染率均为100%。河蚌和河蚬感染度分别为162.3条/个、2.84条/g和6.9条/个、1.73条/g。三组感染大鼠于30 d、40 d、58 d的死亡率分别为100%、75%、25%。结论河蚬、河蚌可为广州管圆线虫适宜中间宿主。     

温州福寿螺体内广州管圆线虫幼虫分布情况的研究

目的了解温州福寿螺体内广州管圆线虫幼虫的分布情况，为防治提供依据。方法人工消化３６１只福寿螺。结果福寿螺感染率为６９．４％。幼虫在螺体内分布依次为腮６１．３％，肾１６．３５％，消化道１２．６２％，肌肉９．９３％，肝０．７％。结论福寿螺内脏及肌肉中幼虫感染率均高于国内其他疫螺。     

广州管圆线虫Asp-1基因的克隆表达及各虫期转录水平研究

目的构建广州管圆线虫天冬氨酰蛋白酶(Asp-1)基因的原核表达系统,研究该基因在各虫期的转录水平。方法构建重组质粒pET-30a(+)-Asp-1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达载体,经IPTG诱导表达后,Ni-IDA亲和层析纯化表达产物。通过以β-肌动蛋白为内参、以各期虫cDNA为模板的实时荧光定量PCR,研究该基因在各虫期的表达水平。结果获得纯化的重组蛋白,相对分子质量约为43000,与生物信息学分析预测结果一致。qRT-PCR显示该基因在三期幼虫中表达丰度最高,四/五期幼虫、成虫雄虫、雌虫依次降低。结论 Asp-1基因的表达丰度在三期幼虫中最高的实验数据与三期幼虫感染性最强的事实相符,提示天冬氨酰蛋白酶有可能是幼虫入侵宿主的关键酶,为后续广州管圆线虫虫体侵入宿主的机制以及宿主保护机制研究打下基础。     

广州管圆线虫Mr32000抗原的免疫诊断效果评价

目的 评价广州管圆线虫Mr32000抗原(AC32)的诊断价值。方法 利用切胶纯化法从广州管圆线虫成虫抗原中获取AC32,用Westernblotting和ELISA方法检测61例广州管圆线虫感染大鼠血清、5例正常鼠血清、1例广州管圆线虫病人血清、50例其他寄生虫体阳性患者血清和50例献血员血清。结果 AC32和成虫粗抗原包被的ELISA检测61份感染大鼠血清和1例临床诊断为广州管圆线虫病人血清均为阳性;AC32-ELISA检测的50例献血员、20例急性血吸虫病人、11例弓形虫病人和所检测的其他寄生虫抗体阳性患者血清均为阴性。结论 AC32在广州管圆线虫病的血清学诊断中具有较高的敏感性和特异性。     

广州大学城广州管圆线虫疫源地调查

目的捕捉广州大学城褐云玛瑙螺(Achatina fulica)检查广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)第Ⅲ期幼虫的感染情况。方法采集大学城10所高校生活区和教学区褐云玛瑙螺,人工消化酶消化分离第Ⅲ期幼虫,计算感染率和感染度并与广州其他地区进行比较。结果除广东外语外贸大学、华南理工大学2个校园内未捕捉到褐云玛瑙螺外,其他8所高校均发现有褐云玛瑙螺;广州大学城广州管圆线虫总体感染率为11.8%(76/642),平均感染度为872条/螺,阳性螺中最高15725条,最低17条;中山大学校园内感染率和感染度比其他校园高,分别为22.0%(56/255),1007条/螺。结论广州大学城广州管圆线虫感染率低于广州其他地区。     

人胎肝cDNA文库构建及鉴定

从人胎肝组织提取总ＲＮＡ并纯化出ｍＲＮＡ，经反转录合成第一、二链ｃＤＮＡ，去除小于２００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，与去磷酸化的λｇｔ１１噬菌体长、短臂连接，体外包装后感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，成功构建含４．２×１０８重组子的人胎肝ｃＤＮＡ表达文库，重组子平均外源插入片段约１．５ｋｂ，适合用于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

0　引言2 0世纪 90年代起 ,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手 ,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要 [1] .我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体 ,其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段 .找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义 .利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建c DNA文库 [2 ] ,继而进行筛选、克隆等 .我们选取与几株单抗的免疫荧光及 Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株 HHCC作为建库材料来源 ,以λgt11DNA为载体 ,构建了人肝癌细胞 c DN…     

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的　构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。　方法　提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。　结果　未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。　结论　已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD NA表达文库