广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA表达文库中优势诊断抗原的筛选、鉴定和克隆

目的 筛选与广州管圆线虫感染小鼠血清具有较强免疫反应性的优势诊断抗原.方法 用感染广州管圆线虫21 d的小鼠感染血清做免疫探针筛选广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA表达文库,对筛选得到的阳性克隆进行插入片段的测序和生物信息学分析,再根据测序结果设计引物扩增该基因并将其克隆入PET-30a(+)载体中.结果 共获得6个阳性克隆,经DNA测序及同源性分析表明,发现其中2个与广州管圆线虫髓鞘转录因子1(MYTl)高度同源,1个与广州管圆线虫胶原蛋白家族基因(alpha-collagen)高度同源,且均为全长cDNA.克隆出广州管圆线虫MYT1全长cDNA序列,构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符合的目的片段.结论 用感染小鼠血清作为探针初步筛选到2个广州管圆线虫基因,并成功构建MYT1的原核表达重组质粒PET30a(+)-MYT1.     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

广州管圆线虫半乳凝素基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫反应性研究

目的 构建在E.coli中高效表达广州管圆线虫半乳凝素蛋白的重组表达质粒,并对重组蛋白纯化条件进行优化及免疫反应性鉴定.方法 根据本室构建的广州管圆线虫幼虫cDNA文库EST测序结果,筛选出有诊断潜能的半乳凝素基因,经过PCR扩增其cDNA全长序列后克隆入pET32a( )载体进行诱导表达,包涵体经洗涤、变性、逐步透析复性,浓缩后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹.结果 本研究首次克隆出广州管圆线虫半乳凝素蛋白基因全长cDNA序列(GenBank收录编号为DQ384534).成功构建重组质粒pET32a( )-Ac GAL,通过IPTG诱导得到以包涵体形式表达的重组融合蛋白,Western-blot结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性.结论 克隆表达了广州管圆线虫半乳凝素基因,为广州管圆线虫病诊断研究奠定了基础.     

小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的 检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法 设计寡核苷酸探针。应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切取所需目的片段．利用分子克隆技术与pcDNA3．1／MycHisC（＋）质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果 原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列（NM—138309）比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1．mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论 小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T．A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1．mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。     

单克隆抗体检测广州管圆线虫循环抗原的研究

目的制备抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单克隆抗体,用于广州管圆线虫循环抗原（CAg）的检测。方法广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2／0）融合,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹试验对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,双抗体（单抗3F1和4H2）夹心ELISA法检测实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠和广州管圆线虫病人血清中的CAg。结果获得了3株稳定分泌抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定2株为IgG1（3F1、4H2）,1株为IgM（2A2）,杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：25600、1：25600和1：12800,诱生腹水ELISA效价分别为1：80000、1：80000和1：40000。3株单抗均识别广州管圆线虫成虫相对分子量约为15000的蛋白。实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠血清CAg检出率分别为84．2％（48／57）和87．2％（41／47）,广州管圆线虫病人血清CAg检出率为86,4％（19／22）,与日本血吸虫、囊虫、肺吸虫、旋毛虫病人血清无交叉反应。实验感染小鼠血清CAg第2周即呈阳性反应,第4周A。。值达到高峰。结论建立了敏感性高、特异性强的3P1、4H2双抗体夹心ELISA检测广州管圆线虫循环抗原法,可用于广州管圆线虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查。     

大鼠全长OBRb cDNA克隆及真核表达重组体的构建

目的克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cDNA(OBRb cDNA)及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法应用RT-PCR方法分段扩增全长OBRb cDNA,再将它们连接起来,并获得载有全长OBRb cDNA的阳性克隆质粒.将上述质粒中全长OBRb cDNA定向插入真核表达质粒pcDNA3中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果重组的克隆质粒和真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小均与理论值一致.结论成功地克隆了SD大鼠全长OBRb cDNA,并构建了真核表达重组体.     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库构建

目的 构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵差异新基因奠定基础.方法 以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后14 d的大劣按蚊作为T 组和D 组,采用抑制差减杂交方法和T/ A克隆技术构建按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入...     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF cDNA FRAGMENTS AND FULL-LENGTH cDNA DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN HUMAN GLIOBLASTOMA CELL LINE BT-325 VERSUS ALL-TRANS RETINOIC ACID INDUCTION

Objective. To investigate the differentiation process of the human glioblastoma cells. Methods. Differential display reverse transcribed-PCR(DDRT-PCR) was used to isolate the genes differentially expressed in control and all-trans retinoic acid treated human glioblastoma cell line BT-325. Routine method of cDNA library screening was performed to clone full-length cDNA. Results. Thirty-six RT-PCR reactions were performed and 64 differentially expressed fragments were recovered, amplified and cloned. Of them,46 ESTs were sequenced and delivered into the GenBank. The homology comparison us-ing BLAST algorithm revealed that 22ESFs are highly homologous with the known genes and many of them play impor-tant roles in the cell differentiation progress. A dot-blot hybridization was conducted to certify the differemiation expres-sion. The result showed that 27 EST clones are expressed at different level in control and all-traus retinoic acid treated BT-325 cells. A full-length cDNA was cloned using the EST-HGBB098.Conclusion. DDRT-PCR was a simple and effective method to segally analyze the differentially expressed genes.     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

Suppression subtractive hybridization for identifying differentially expressed genes in renal cell carcinoma

Objective To construct a renal cell carcinoma (RCC) cDNA subtractive library using suppres sion subtractive hybridization.Methods Polyadenylated RNA ［Poly (A)(+) RNA］ was isolated from tissues of RCC and norm al kidney, and single- strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn. RCC cDNAs were divided into two groups and ligated to the specific adaptors l and 2, and then h ybridized with normal kidney cDNA twice with two rounds of suppression PCR. Sec ond round PCR products were cloned to T/A plasmid vectors to set up the subtract ive library. One hundred clones were randomly picked to perform enzyme digest a nalysis, and some underwent sequence analysis and Northern blot to identify RCC specifically expressed genes. SMART RACE procedure was operated to clone full l ength novel RCC specifically expressed genes.Results A human RCC subtractive library with high subtractive efficiency was successfull y set up. The amplified library contains 350 positive clones. Random analysis of 100 clones with enzyme restriction showed that 85 plasmids in the clones cont ained 50-400 bp inserts. Sequence analysis was performed for 10 clones. All t he 10 sequences were unknown before and derived from 6 unique, novel genes among which the cDNA insert RCC18 had five copies. Northern blot analysis showed tha t RCC18 cDNA was highly expressed in RCC, but no signal could be detected in nor mal kidney. Using SMART RACE technique, we obtained the full length of the nove l gene RCC18.Conclusions The constructed cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays a solid foundation for large scale screening and cloning new and speci fic oncogenes or tumor suppressor genes of RCC. The novel specifically expresse d genes provided an important clue for studying the mechanisms of occurrence and development of RCC.     

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.