人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53．33％、73．33％、86．67％。联合消化组较胰酶组培养成功高（氏0．05）。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异（B〉0．05）。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间．具有降低培养成本的优点。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

子宫内膜异位症体外细胞模型的建立

目的从子宫内膜组织分离腺上皮细胞和间质细胞，建立子宫内膜异位症体外多细胞模型。方法收集子宫内膜异位症和其他良性疾病的在位子宫内膜，采用高浓度胶原酶消化法进行内膜细胞的原代培养，以及传代培养。观察两组细胞形态，SABC免疫细胞化学进行细胞鉴定，MTT法绘制两组细胞的生长曲线。结果高浓度胶原酶消化后，子宫内膜异位症组和对照组腺上皮细胞和间质细胞大部分在48h内都能贴壁；腺细胞平均生长时间为6周；间质细胞平均生长时间为15周。腺上皮细胞角蛋白（cytokeratin）免疫细胞化学染色呈阳性，渡形蛋白（vimentin）为阴性；间质细胞角蛋白染色为阴性，而波形蛋白为阳性。两组生长曲线接近。结论高浓度胶原酶消化法建立子宫内膜异位症体外多细胞模型简单、易行。子宫内膜异位症在位内膜细胞的形态、生长和正常内膜细胞无明显差异。可以用作研究子宫内膜异位症细胞基因型特征、及其他因素对异位内膜细胞的影响的模型。     

高纯度子宫内膜腺上皮细胞的体外分离和培养

目的:在体外建立子宫内膜腺上皮细胞原代分离和培养的方法,以获得高纯度子宫内膜腺上皮细胞。方法:选择正常子宫内膜组织,通过消化、过滤、选择性贴壁和二次消化等技术进行体外培养。结果:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法成功实现子宫内膜腺上皮细胞的高纯度分离和原代培养。结论:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。     

分离培养子宫内膜腺上皮和间质细胞方法的改进

目的:探索一种获得高产量、高纯度子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的分离培养方法.方法:通过高浓度胶原酶和DNase联合消化、过滤及贴壁纯化等技术,分离培养30例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并拟传代.结果:29例标本培养成功,每1g子宫内膜组织约可分别得到(40～50)×106个腺上皮细胞和(40～50)×106个间质细胞,细胞产量高.并且腺上皮细胞纯度率约96%,间质细胞纯度率达98%以上.间质细胞可以有限传代,腺上皮细胞不能传代.结论:通过改良步骤,可提高腺上皮和间质细胞产量,同时保证了其纯度及活性,不失为一种较理想的子宫内膜细胞分离培养方法.     

人子宫内膜细胞纯化方法的研究

目的探讨一种人子宫内膜细胞体外分离培养的方法。方法将离体子宫内膜组织立即放入无菌瓶中,冲洗、剪碎,0.1%Ⅰ型胶原酶消化2h,100目和300目细胞筛分离上皮细胞和间质细胞,分别离心（前者700r/min,离心5min,后者1000r/min,离心10min）,应用含20%胎牛血清的DMEM培养基体外培养,并通过免疫细胞染色进行鉴定。结果胶原酶消化及细胞筛过筛后离心可以完全分离子宫内膜上皮细胞和间质细胞,并分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性。结论该方法简单,费用低廉,能达到完全分离子宫内膜细胞的目的。     

改良式筛网法人子宫内膜细胞的分离与纯化

目的探讨改良式筛网法在分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中的应用价值。方法通过高浓度胶原酶结合不同浓度、时间消化、过滤及贴壁纯化等技术,应用筛网分离法培养各15例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并传代。结果改良式筛网分离法培养中的15例标本中,腺上皮细胞和间质细胞成功率分别为93.3%和93.3%;分离出的腺上皮细胞及间质细胞可体外培养,经分离纯化后腺上皮细胞纯度>90%,间质细胞纯度>98%;两种细胞经传代后间质细胞成功率92.9%;腺上皮细胞传代培养后活力下降,成功率14.3%。结论通过改良式筛网分离法能获得纯度较高的腺上皮细胞与间质细胞;间质细胞可行传代培养;腺上皮细胞传代培养后活力下降,不宜传代。     

高纯度子宫内膜细胞分离和体外培养技术及其应用

目的：分离、纯化子宫内膜间质细胞（ESC）和腺上皮细胞，建立体外ESC蜕膜化模型。方法：选择正常育龄妇女的新鲜子宫内膜组织，经多酶消化制成细胞悬液，分离、纯化间质细胞和腺上皮细胞；分别培养至细胞聚合成片，随机分组，用等渗浓度的甾体激素诱导ESC体外蜕膜化改变。结果：分离的间质细胞其纯度达95%以上，其细胞活力达92%——95%。在此体外培养系统中，ESC对生理剂量激素的应答出现与活体相仿的蜕膜化改变。结论：利用此技术可在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及其调节。     

子宫内膜间质细胞模型的建立

目的 为进一步实验需要,建立子宫内膜间质细胞模型。方法 胶原酶消化联合应用差速离心和密度梯度离心法分离纯化目的细胞;恒温孵箱培养细胞;倒置显微镜观察细胞形态;台盼兰染色计数细胞存活率;免疫组化鉴定细胞。结果 该方法分离纯化子宫内膜间质细胞的存活率高,形态与子宫内膜腺上皮细胞易区别。体外培养的间质细胞具有一定分裂增殖能力,传代培养的形态特征与原代细胞一致。免疫组化显示Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（＋）－Ｋｅｒａ     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .