缺血皮质神经元DNA单链损伤引发Noxa表达的研究

目的：观察类缺血损伤神经元再灌注不同时间点DNA单链损伤情况和BH3－only家族成员Noxa的表达情况，初步研究DNA单链损伤与Noxa的表达关系。方法：应用β-Tubulin及Gap-43对培养的皮质神经元进行鉴定。利用流式细胞仪对培养的皮质神经元类缺血再灌注损伤后Noxa的表达情况进行研究。DNA聚合酶－IKlenow片段介导的dATP－生物素切口末端标记方法（Klenow法）对缺血再灌注各时间点培养的神经元进行检测，并应用图象分析仪对Klenow法检测的结果进行平均灰度检测。结果：应用β－Tubulin及Gap-43培养的神经元80％为纯神经元，给予神经元类缺血处理后，在再灌注不同时间点Noxa的表达为在再灌注0．5，1h最强，而后随着再灌注时间的延长，Noxa的表达下降，Klenow法检测发现未经缺血处理的对照组神经元平均灰度为72．4&;#177;1．0，到达2h达高峰135．5&;#177;1．3，而后又逐渐降低，24h几乎看不到阳性细胞。结论：培养的皮质神经元类缺血再灌注处理后有Noxa的表达，在再灌注0．5h和1h为Noxa的表达高峰，DNA单链损伤高峰为2h,Noxa的表达高峰时间点早于DNA单链损伤高峰的时间点，说明NOXA的表达可能还有其他形式的DNA损伤介入。     

大鼠大脑中动脉阻塞后DNA单链断裂损伤的实验研究

目的 观察大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)后，相应区域DNA断裂损伤情况，探讨DNA单链损伤在pMCA0所致脑组织损伤中的意义。方法 采用常规HE组织染色明确大鼠pMCAO模型成功与否及其损伤范围，采用DNA聚合菌—l K1enov片段原位杂交方法检测pMCAO不同时间点DNA单链断裂损伤情况。结果 损伤区域单链DNA断裂的K1enov阳性细胞在pMCA0后6h即有表达(P＜0．01），在24h时达到高16(P＜0．01)，72h时有所下降(P＜0．01)。结论 单链DNA断裂损伤在pMCA0后6h即可出现，并逐渐积累，成为缺血半暗带内细胞损伤发展过程的重要环节，并可能预示半暗带损伤范围的不断扩大。     

DNA修复蛋白PARP基因在大鼠缺血脑组织中的表达

目的　探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后DNA修复蛋白PARP基因表达的时空改变及其与凋亡的关系。方法　采用大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型 (MCAO R) ,运用原位杂交技术观察缺血再灌注PARPmRNA的时空分布 ,结合TUNEL技术观察其与凋亡的关系。结果　脑缺血 30min再灌注 1hPARPmRNA表达增加 ,随缺血或再灌注时间的延长表达逐渐增强 (P <0 0 5 ) ,与凋亡的时间变化规律相似 ,但范围大于并涵盖凋亡的范围 ,凋亡分布区外侧的缺血区表达也明显增加。结论　脑缺血 /再灌注损伤可诱导神经细胞DNA修复蛋白PARP基因的转录增强 ,PARP可能参与脑缺血损伤后的DNA修复。     

局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元DNA氧化损伤的研究

目的：研究8－羟基－2′－脱氧鸟苷（8－OHdG)在大鼠局灶性脑缺血－再灌注后的表达情况。方法：采用栓线法制备大脑中动脉再灌注大鼠模型,按再灌注时间不同分为4组,利用免疫组织化学方法显示8－OHdG在脑内的表达,并用寡核苷酸末端核糖核酸转移酶（TdT)介导的dUTP缺口原位末端标记（TUNEL）法标记DNA片段。结果：正常组和假手术组大鼠脑内偶见8－OHdG阳性细胞,缺血2小时再灌注2小时时,缺血区散在8－OHdG阳性细胞;再灌注24小时时,8－OHdG阳性程度达到高峰;48小时时,缺血区内的神经细胞显示中度的8－OHdG阳性,缺血区外的神经细胞为强阳性,此处的细胞TUNEL染色为阴性。结论：脑缺血－再灌注后,DNA氧化损伤比细胞死亡发生范围更加广泛,DNA氧化损伤并不一定导致细胞死亡。抗氧化治疗可能在限制脑缺血－再灌注时氧化应激中起重要作用。     

应用胎鼠皮质神经元建立缺血再灌注损伤模型

目的：用原代培养的胎鼠皮质神经元建立缺血再灌注（IR）模型。方法取孕18~21d的c57BL/6胎鼠大脑皮层,用胰酶消化后进行培养,用免疫荧光法进行鉴定。神经元用石蜡油覆盖,一定时间后更换全培养基,之后在不同时间点收集细胞提取RNA,用RT-PCR法检测白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA的表达。结果神经元纯度＞90%,与对照组比较,神经细胞在更换培养基后各细胞因子转录水平增加,更换培养基后24h上清液液中各细胞因子蛋白表达均明显增高,6h后,凋亡显著增加。结论可获得高纯度的原代神经元;用石蜡油可成功建立神经元体外模拟缺血再灌注模型。     

大鼠大脑中动脉阻塞后DNA单链断裂损伤的实验研究

目的观察大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)后,相应区域DNA断裂损伤情况,探讨DNA单链损伤在pMCAO所致脑组织损伤中的意义。方法采用常规HE组织染色明确大鼠pMCAO模型成功与否及其损伤范围,采用DNA聚合酶-1Klenow片段原位杂交方法检测pMCAO不同时间点DNA单链断裂损伤情况。结果损伤区域单链DNA断裂的Klenow阳性细胞在pMCAO后6h即有表达(P<0.01),在24h时达到高峰(P<0.01),72h时有所下降(P<0.01)。结论单链DNA断裂损伤在pMCAO后6h即可出现,并逐渐积累,成为缺血半暗带内细胞损伤发展过程的重要环节,并可能预示半暗带损伤范围的不断扩大。     

缺血缺氧及再灌注后海马神经元损伤的时间窗特性

目的：探讨缺血缺氧及再灌注损伤后大鼠海马神经元在伤后不同时间的凋亡及死亡特性，阐明神经元损伤发生的时间窗特征。方法：实验于2004—05／06在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所进行。体外培养胚胎大鼠海马神经元，模拟临床缺血过程致神经元缺氧损伤，采用Annexin V联合PI标记和流式细胞检测技术观察伤后不同时间点的凋亡与死亡情况。结果：海马神经元缺氧损伤后，其细胞损伤的形式为凋亡和坏死同时存在；模拟缺血15，30min，1．0，1．5，2．0，2．5和3．0h，其坏死率分别为(1．37&;#177;0．12)％，(3．71&;#177;0．34)％，(16．47&;#177;1．27)％，(18．73&;#177;2．02)％，(19．77&;#177;2．32)％，(22．13&;#177;2．12)％和(28．78&;#177;2．69)％，相互间差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，各时间点的凋亡率分别为(6．23&;#177;1．67)％，(6．56&;#177;2．38)％，(6．73&;#177;2．42)％，(6．95&;#177;1．89)％，(7．16&;#177;2．82)％，(6．93&;#177;2．56)％和(7．23&;#177;2．89)％，凋亡率无明显变化(P&;gt;0．05)。各时间点再恢复糖和氧供应后至24h，海马神经元存活率进一步明显下降，坏死率进一步增多，各时间点神经元坏死率分别为(6．98&;#177;1．23)％，(8．46&;#177;1．37)％，(17．68&;#177;2．97)％，(20．79&;#177;3．16)％，(21．67&;#177;3．05)％，(35．53&;#177;3．33)％和(50．22&;#177;4．19)％，差异亦有显著性意义(P&;lt;0．05)；凋亡率亦逐渐增多，模拟缺血15，30min，1．0，1．5和2．0h时间点的再灌注24h，其神经元凋亡率分别为(11．89&;#177;2．06)％，(14．92&;#177;2．64)％，(28．67&;#177;3．05)％，(44．67&;#177;3．78)％和(61．67&;#177;4．89)％，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，但模拟缺血2．5h和3．0h时间点再灌注24h的神经元凋亡率为(27．76&;#177;3．15)％和(12．67&;#177;2．27)％，其凋亡率反而显示明显下降。结论：凋亡是延迟性神经元死亡的重要通路，脑缺血缺氧的干预治疗时间窗可以提前至2h内。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注DNA损伤随再灌注时程在各脑区的动态分布

背景：近年来对于缺血半影区的研究，涉及脑组织血流量、能量代谢、蛋白质合成率、细胞凋亡以及相关蛋白质表达等多个方面，然而对于DNA单链与双链损伤的动态分布研究很少。目的：研究大鼠大脑中动脉缺血再灌注时，DNA损伤随再灌注时程在各脑区的动态分布情况。设计:随机对照的实验研究。地点和对象:本实验在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成；选择健康纯系Wistar大鼠28只，体质量200～230g，雌雄各半，所有动物均由同济医学院动物饲养中心提供。干预:用线栓闭合大鼠大脑中动脉30min，然后分别再灌注30min，1，2，4，6，12，24，48h。采用原位PANT(DNA聚合酶Ⅰ介导的生物素标记的dATP缺口平移)及原位TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记)，分别检测DNA损伤的单链断裂及双链断裂。主要观察指标：观察单链断裂细胞和双链断裂细胞在大鼠前囟水平冠状切面的脑组织切片各区域的分布。结果：缺血30min(再灌注以前)各脑区均未检测到PANT或TUNEL阳性细胞。再灌注1h在尾壳核区检测到DNA单链断裂，再灌注2h在该区和梨状皮质检测到DNA双链断裂；再灌注24h以前各时间点DNA单链断裂和双链断裂细胞数依次增多，并且出现在顶叶皮质和额叶皮质，再灌注48h二者均减少；再灌注各时间点，分布在尾壳核和梨状皮质的PANT或TUNEL阳性细胞数量显著多于分布在额叶皮质及顶叶皮质的数量(P&;lt;0．05)。结论：大鼠大脑中动脉缺血30min再灌注的线栓模型，尾壳核和梨状皮质是受缺血影响的中心区域，额叶和顶叶皮质是受缺血影响相对较轻的区域，可能是缺血半影区。     

脊髓缺血再灌注损伤中热休克蛋白表达的研究

目的研究脊髓缺血再灌注损伤(SCII)后热休克蛋白(HSP70)表达的变化。方法制作SCII动物模型,采用光镜、激光多普勒超声、免疫组化等技术,研究SCII后HSP70表达的变化。结果(1)缺血30min,血灌流量平均下降85.37%,再灌流即刻血灌流量迅速升高,再灌流10min左右达到最高点。再灌流30min,血灌流量基本恢复到缺血前的基线水平,以后逐渐降低。(2)缺血后部分大鼠再灌注后出现“二次瘫痪”现象。(3)脊髓缺血30min再灌注60min后即有HSP70的表达增强,随着再灌注时间的延长,HSP70表达逐渐增多,在再灌注240min达到高峰。此后,HSP70表达逐渐减少,在再灌注24h基本消失。结论(1)脊髓缺血一定时间后恢复血液供应,可以发生再灌注损伤。(2)脊髓缺血再灌注后HSP70的表达增加。     

术后缺血再灌注损伤1例分析

对术后缺血再灌注损伤1例分析如下. 1 病历摘要 男,13岁.于2005-08-17因脑积水术后1.5 a、头痛10 d入院.查体:步入病房,神志清,对答正确,头围较大,五官端正,双侧视乳头苍白,双瞳等大等圆,光反应(+),双眼活动自如,无明显面瘫,咽反射(+),颈抵抗(-),双肺呼吸音清,律齐,肝脾未及,脊柱生理弯曲,四肢肌力肌张力正常,腱反射存在,双下肢病理征(-).     

类缺血后神经元内钙离子浓度变化及不同钙阻滞剂对其影响

目的观察类缺血后神经元内钙离子浓度及细胞活性的变化,探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及不同钙阻滞剂的作用。方法采用孕小鼠皮层神经元培养技术,应用相差显微镜观察培养的神经元形态结构,激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子浓度。结果给予神经元类缺血处理10min后,神经元内钙离子浓度明显高于尼卡地平组(P<0.01)。类缺血处理10min后再灌注2h细胞损伤程度较尼卡地平干预组有显著性差异。结论尼卡地平可抑制神经元细胞内钙离子浓度的升高,降低缺血性神经元的损伤的程度。     

MgSO4对神经元NMDA兴奋毒性损伤的剂量依赖保护作用

目的研究镁离子（Mg^2＋）对神经细胞兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）损伤的保护作用。方法采用原代培养的大鼠皮层神经细胞模型,给予NMDA损伤,加入不同浓度的Mg^2＋,测定神经细胞损伤噻唑蓝（MTT）变化。结果Mg^2＋对兴奋性氨基酸损伤保护作用在1．0～3．0mmol／L范围内存在,2．0mmol／L效果最可靠。结论在重型颅脑损伤的临床治疗中应尽早使用镁剂,剂量根据脑脊液浓度尽快调整到2．0mmol／L保护作用最好。     

三七皂甙对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨三七皂甙对大鼠脑缺血再灌注后的保护作用。方法采用线栓法建立鼠大脑中动脉局灶缺血再灌注模型。于缺血2h再灌注22h,测定脑梗死体积并观察血脑屏障破坏的程度。结果再灌注后22h,三七皂甙治疗组可有效降低脑梗死体积,明显减轻脑缺血区血脑屏障破坏的程度。结论三七皂甙对脑缺血再灌注有确切的脑保护作用,并能减轻脑缺血再灌注对血脑屏障破坏的程度。     

注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后环氧合酶2表达的影响

目的:研究注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达的影响。方法:健康雄性SD大鼠132只,随机分为假手术组、模型组、治疗组,后两组再分为再灌注6h、24h、48h、3d、5d亚组,每亚组12只大鼠。应用大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,造模成功治疗组即刻腹腔注射七叶皂苷钠5mg/kg/d,其余各组均腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠于不同时间点分别评定神经功能缺损评分,免疫组织化学法检测脑组织COX-2的表达,TTC染色测定脑梗死体积。结果:注射用七叶皂苷钠能显著减少脑组织COX-2的表达,改善神经缺损症状,与各时间点模型组比较,P0.05。结论:注射用七叶皂苷钠对局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能与减少脑组织COX-2的表达有关。     

促红细胞生成素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

目的研究促红细胞生成素（EPO）预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法将30只SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、干预组,每组10只。干预组给予EPO预处理,15min后,对模型组和干预组建立大脑中动脉栓塞模型,建模后2h进行血流再灌注;对假手术组仅建立假手术模型,建模后2h灌注生理盐水。记录各组大鼠神经功能缺陷评分、脑梗死面积、脑神经元凋亡情况,用RT-PCR检测谷氨酸转运体（GLT-1）mRNA的表达量,免疫组化法检测谷氨酸-天冬氨酸转运体（GLAST）蛋白表达。结果干预组大鼠神经功能缺陷评分和脑梗死灶面积明显小于模型组（P均〈0．05）。与假手术组比较,模型组大量神经细胞凋亡,而干预组缺血区仅部分凋亡。脑缺血再灌注后2h,模型组与干预组大鼠缺血区GLT-1 mRNA和GLAST蛋白表达均低于假手术组（P均〈0．05）,而干预组表达水平明显高于模型组（P均〈0．05）。结论EPO预处理可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。     

大鼠创伤性脑损伤早期基因差异表达的研究

目的研究创伤性脑损伤早期基因表达谱与正常脑组织基因表达谱的差异,以期阐明脑损伤后早期基因表达的改变规律,阐明脑损伤发生发展的分子机制,从而为临床治疗提供帮助,同时为法医损伤时间推断研究寻找标志物提供帮助。方法以大鼠自由落体损伤模型为对象,从损伤区脑组织和假手术对照组脑组织分别提取mRNA,经反转录成cDNA后与含有4096个随机基因的基因表达谱芯片杂交,杂交后的芯片经扫描仪扫描,并用GenePix3.0软件分析结果。结果发现有124个差异表达基因或表达序列标签（expression sequencetags,ESTs）;其中有46个基因和26个EST表达下调;28个基因和24个EST表达上调;在这些表达有差异的基因中,有涉及细胞内信号传导、神经递质释放、参与炎症的蛋白、离子通道及其受体蛋白和参与炎症反应的蛋白等被发现。结论创伤性脑损伤的发生发展涉及多个基因的改变;研究一个或少数几个基因很难解释其损伤后分子变化机制;基因芯片是研究颅脑损伤这种多基因改变、多因素作用的理想工具。     

山莨菪碱对家兔急性全脑缺血再灌注期间兴奋性氨基酸释放及生存状况的影响

目的了解山莨菪碱对家兔急性全脑缺血再灌注期间兴奋性氨基酸释放及生存状况的影响。方法５６只家兔采用“闭塞双侧颈总动脉和椎动脉＋体循环低血压法”建立急性全脑缺血再灌注损伤模型。观察山莨菪碱（Ａｎｉ）对缺血再灌注期间脑组织兴奋性氨基酸（ＥＡＡ）含量及动物生存状况的影响。结果Ａｎｉ可降低脑组织ＥＡＡ含量的下降幅度,提高动物２４ｈ生存率,降低神经功能缺陷评分。结论Ａｎｉ可抑制ＥＡＡ过度释放,改善缺血再灌注脑损伤动物的生存状况,在临床脑复苏中可能有一定的应用前景。     

局部用地塞米松对外伤性脑水肿和髓鞘碱性蛋白变化的影响

目的 :研究脑皮质局部应用地塞米松对兔脑外伤后脑水肿和脑组织损害的减轻程度。方法 :2 2只兔随机分为 A(对照组 )和 B(治疗组 ) 2组。应用骨窗成形硬脑膜外打击法制备脑挫裂伤动物模型。B组采用局部微量等距离扩渗法于脑皮质局部损伤灶内注射地塞米松 ;A组以同样方法注射等量生理盐水。以脑组织含水量和血清髓鞘碱性蛋白 (MBP)作为观察指标。结果 :A、B2组兔患侧大脑半球含水量分别为 (81.75± 0 .5 6 ) %和(79.45± 0 .5 2 ) % ,B组显著低于 A组 (P<0 .0 5 )。 A组血清 MBP为 (5 .98± 2 .0 8) μg/L,B组为 (3.15±1.0 9)μg/L ,A、B 2组 MBP均较正常对照值 (1.6 6± 0 .71)μg/L增高 ,但 A组显著高于 B组 (P<0 .0 5 )。结论 :脑挫裂伤后脑含水量和血清 MBP增高 ,治疗后两者均降低 ,说明局部应用地塞米松对脑损伤有明显治疗作用     

PC12细胞缺氧培养后DNA损伤和修复相关基因表达的研究

目的:探讨PC12细胞缺氧后细胞凋亡与DNA损伤和修复的关系,进一步阐明缺氧导致PC12细胞凋亡的机制。方法:采用TUNEL法,结合应用流式细胞术观察PC12细胞缺氧培养不同时间点细胞凋亡现象,以及DNA损伤修复相关基因表达的改变。结果:在缺氧0.5h时,开始出现凋亡细胞,此时P53、P21waf1/cip1蛋白表达也开始增高,GADD45蛋白表达达到高峰(P<0.01)。至缺氧1h凋亡细胞达高峰,此时P53、P21蛋白表达最高(P<0.05),而GADD45表达则明显下降(P<0.05)。至缺氧6—12h,则以坏死为主,此时以上的基因表达均减弱。结论:PC12细胞缺氧早期(0.5—1h),主要出现凋亡为主的细胞死亡,伴随着DNA损伤相关基因表达的动态改变,提示缺氧后PC12细胞凋亡部分是由于DNA损伤严重,损伤不能及时修复所致。     

肿瘤坏死因子-α和细胞粘附分子-1在脑缺血再灌注损伤中的表达规律

Objective To detect the expression of TNF α and ICAM 1 in cerebral ischemia reperfusion injury. To explore their probable modulation mechanism.Methods Immunohistochemistry was used to examine the expression of TNF α and ICAM 1.The MPO activity was determined by spectrophotometry.Result The expression of TNF α and ICAM 1 were obviously rised after cerebral ischemia reperfusion (P< 0.05).Conclusion The up regulation of TNF α and ICAM 1 after cerebral ischemia reperfusion induced the accumulation of leukocytes, which involved in ischemia reperfusion injury mechanism. TNF α play an important role in expression of ICAM 1.