SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达

目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定。方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达。结果SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段。结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

大鼠转化生长因子β3基因的克隆及其转染肝星状细胞后的表达

目的:克隆大鼠转化生长因子β3(TGFβ3)基因并研究其转染肝星状细胞(HSC)后的表达情况。方法:采用逆转录—聚合酶链式应(RT-PCR)从大鼠成骨细胞中扩增出特异性片段,经酶切鉴定证实为大鼠TGFβ3cDNA,将此片段插入pcDNA3.1(+)表达载体,构建得到pcDNA3.1(+)-TGFβ3重组质粒。应用阳离子脂质体介导的基因转移技术将TGFβ3表达载体导入大鼠HSC,24 h、48 h、72 h后用荧光定量PCR法进行瞬时表达的检测。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGFβ3经限制性内切酶NheI、XbaI酶切,电泳后显示的TGFβ3目的片段和5.4 kb的pcDNA3.1(+)载体片段,测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同,证实pcDNA3.1(+)-TGFβ3真核表达载体构建成功,转染48 h后,肝星状细胞的表达明显增高(P0.05)。结论:重组TGFβ3真核表达载体构建正确,并在转染大鼠HSC48 h后获得高效表达,为转基因治疗肝纤维化疾病提供理论依据。     

刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

目的构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK 293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和western blot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果 PCR扩增获得约495 bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK 293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19 kDa。结论成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T正确表达。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

鸭乙型肝炎病毒聚合酶结合模拟肽真核表达载体的构建

目的：构建与鸭乙型肝炎病毒聚合酶(DHBV P)特异性结合的模拟肽的重组真核表达质粒，为进一步将重组质粒转染原代培养鸭肝细胞研究模拟肽的作用奠定基础。方法：以噬菌体肽库中筛选出来的能特异性结合DHBV P的模拟肽基因为模板，扩增模拟肽基因片段，并应用基因重组技术构建其真核表达载体pEGFP-N1-模拟肽基因(pEGFP-N1-M)。结果：经鉴定，目的基因片段以正确的方向插入载体pEGFP-N1中，序列正确，对码正确。结论：成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-N1-M。     

肾上腺髓质素基因腺病毒表达载体的构建及其对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:构建表达大鼠AM基因的重组腺病毒载体,探讨其对MSCs增殖的影响.方法:设计AM基因上下游引物,以大鼠肾脏组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得AM基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-AM.经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞.制备病毒上清并测定其滴度,并感染大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT方法评估其对MSCs增殖的影响.结果:完成构建含有AM基因的重组腺病毒,RT-PCR及Western blot检测证实AM在MSCs中表达,并能够促进其增殖(缺氧组与缺氧 AM组相比,P＜0.01).结论:构建重组腺病毒载体,并在MSCs表达AM蛋白.     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kimse,AK)基因真核表达载体并予以鉴定.方法 根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性.克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1( ),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1( )-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性.结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段.结论 成功地构建了基因真核表达载体.     

幽门螺杆菌热休克蛋白A核酸疫苗的构建

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A (HspA)亚单位核酸疫苗,为进一步研制Hp核酸多价疫苗提供技术平台.方法 以PMD-HspA为模板,扩增、纯化Hp hspA基因,插入到真核表达载体PcDNA3中,转化大肠埃希菌DH5a,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,得到重组核酸疫苗pcDNA3-HspA,用特异性PCR方法和小提质粒酶切电泳鉴定重组质粒,同时将pcDNA3-HspA进行测序,进一步确定是否构建成功及鉴定构建过程中是否发生基因突变.结果 PCR鉴定结果显示,扩增产物为0.36 kb的目的基因;酶切鉴定结果显示,得到5.45 kb克隆载体片段和0.36 kb的目的基因片段;重组质粒pcDNA3-HspA测序,得到基因全长357 bp目的基因片段,与克隆质粒测序图比较,无基因变异.结论 成功构建了Hp单价核酸疫苗pcDNA3-HspA,为研制Hp核酸多价疫苗奠定基础.     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

miR-145真核表达载体的构建及表达

目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。     

甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白HA1真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白(HA1)的真核表达载体,并表达其编码蛋白HA1。方法利用RT-PCR技术扩增HA1基因,克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T-HA1质粒。双酶切pMD18-T-HA1与PXJ40后回收并连接回收片段,构建PXJ40-HA1真核表达载体,鉴定后转染293T细胞,用免疫印迹法(western-bolt)鉴定重组HA1蛋白的表达。结果实验成功构建HA1基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达出分子量为40kD的重组蛋白。结论成功构建的甲型流感病毒SwH1N1HA1基因的真核表达载体,可为后期的流感快速检测及基因工程疫苗的制备奠定良好的基础。     

hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立

目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

重组人促红细胞生成素四环素调控真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定含有四环素调控的pTRE顺式作用元件的质粒型载体pTRE2hyg-rhEPO。方法设计含BamHⅠ和ClaⅠ酶切位点的hEPO基因引物，采用RT-PCR法从含有rhEPO基因的CHO细胞中克隆hEPO基因片段，亚克隆至pTRE2hyg真核表达载体。转化感受态大肠杆菌Tbp10，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经RT-PCR能扩增出604bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论成功构建了重组人EPO四环素调控真核表达载体pTRE2hyg-rhEPO。