葡萄球菌肠毒素A和B7.1双刺激分子共转染人肝癌细胞及其免疫学效应

超抗原(SAg)是来源于细菌和病毒家族的蛋白组份,可未经处理而直接结合于组织相容性复合物Ⅱ分子并激活含特定Vβ成份的T细胞。为开辟超抗原在T细胞介导的肿瘤免疫排斥中的新途径,我们将葡萄球菌肠毒素A(SEA)超抗原分子及共刺激分子B7.1的基因直接转入人肝癌细胞,从而诱发强的免疫排斥反应。     

葡萄球菌肠毒素B突变体的免疫原性研究

目的：研究葡萄球菌肠毒素B(SEB)突变体的免疫原性和作为超抗原疫苗的应用前景。方法：利用小鼠动物模型，分别对SEB23位突变体(SEB-M23)和150位突变体(SEB-M150)作毒力、免疫原性和保护力试验。结果：小鼠致死性试验表明，与野生型SEB(SEB-N)相比，SEBM23的毒力大幅度下降，而SEB-M150的毒力则未见下降。淋巴细胞增殖试验发现，SEB-M150与SEB-N相比，cpm掺入量相似．说明150位突变并不影响SEB超抗原的活性；SEB-M23与SEB-N相比，其cpm掺入量显著下降，表明23位突变可显著降低SEB超抗原活性。ELISA结果显示，以SEB-N、SEB-M23、SEB-M150三种蛋白免疫小鼠，都能诱生一定量的抗体。且产生的抗体水平非常接近，无统计学意义。主动免疫治疗和被动免疫治疗结果证明，SEB-M23蛋白免疫的小鼠能抵抗野生型SEB致死剂量的攻击，同时被动转移免疫小鼠的抗血清能保护接受致死剂量SEB-N的小鼠免于死亡。结论：SEB-M23毒力低、免疫原性强，有可能成为一种很有希望的超抗原候选疫苗，用于某些疾病的预防。     

葡萄球菌肠毒素检测方法的研究

建立一种酶免疫斑点法(Dot-ELISA)用于检测葡萄球菌肠毒素(SET),对SET-A、B、C 3型的检测敏感度均达到0.1ng/ml,与金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)不发生交叉反应,是一种较为理想的SET检测方法,检测效果明显优于澳大利亚PTY检测试剂盒。     

重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和序列分析

目的　采用基因工程技术制备金黄色葡萄球菌B型肠毒素 (SEB)。方法　根据SEB已知序列 ,设计一对引物 ,用PCR方法从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增出基因片段 ,克隆到原核表达质粒 pET32a上 ,转化大肠埃希菌JM10 9感受态细胞 ,经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。结果　PCR扩增产物大小为 74 0bp ,重组质粒经双酶切PCR鉴定表明已正确重组 ,测序结果与已知序列基本吻合。结论　成功地克隆了金黄色葡萄球菌B型肠毒素 ,为下一步研究发病机制奠定基础。     

产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达

目的分离产A型肠毒素金黄色葡萄球菌标准株,克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),研究其生物学特征。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,亚克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达和纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得抗血清,进行重组蛋白免疫原性分析。结果成功克隆SEA全长基因,经DNA序列分析证实与GenBank收录序列具有100%的同源性。表达蛋白相对分子质量为31000,以包涵体形式存在。纯化、复性后获得有活性的rSEA蛋白,rSEA蛋白能够识别天然的SEA。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,rSEA具备抗原性,为制备单抗、诊断试剂及金黄色葡萄球菌致病机制研究奠定了基础。     

葡萄球菌肠毒素A基因真核表达系统的构建及其目的重组蛋白的鉴定

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况。方法 采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCCl3565菌株中扩增全长SEA，目的扩增片段T-A克隆后测序。经核酸内切酶酶切重组质粒pUCm-T-SEA获得的pUCm-T-SEA基因片段与真核表达载体pPIC9K连接。采用电融合法将重组真核载体pPIC9K-SEA转化入P．pastoris GSll5株，构建成真核表达系统pPIC9K-SEA-P．pastoris GSll5。采用含G418抑制剂的YPD琼脂平板和PCR筛选并鉴定pPIC9K-SEA-P．pastoris GSll5。0．5％(V：V)甲醇诱导下，采用SDS-PAGE检查BMMY液体培养基上清中重组SEA(rSEA)的表达情况。结果可从S．aureus ATCCl3565株DNA中扩增获得SEA目的片段。与报道的SEA基因序列(GenBankNo．：AP004828 and L22566)比较，所克隆的SEA基因核苷酸及氨基酸序列的相似性分别高达98．84％～100％和100％。在甲醇的诱导下，pPIC9K-SEA-P．pastoris GSll5能表达在SDS-PAGE图谱位于预期位置的rSEA。结论我们成功地构建了能表达SEA的真核表达系统，为进一步分析SEA分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对体外培养小鼠胚胎发育的影响

目的了解金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对胚胎发育的影响。方法采用植入后全胚胎培养技术,将8.5d小鼠胚胎与终浓度分别为0.1、1及10μg/ml的SEB共培养48h后,观察SEB对胚胎生长发育和器官形态分化影响。结果SEB可影响体外小鼠胚胎的发育。0.1μg/mlSEB首先影响卵黄囊直径,当SEB为1及10μg/ml时,胚胎生长发育指标和器官形态分化评分均明显低于对照组,并出现小头、脑膨出、前后神经管未闭、体位异常、鳃弓及前肢发育迟缓、大心包及心包积液等畸形。结论SEB能明显影响体外小鼠胚胎发育,可能是金葡菌L型导致体外胚胎发育畸形的主要机制之一。     

金黄色葡萄球菌A蛋白协同凝集试验检测慢性血吸虫病患者循环抗原的研究

目的：探讨金黄色葡萄球菌Ａ蛋白协同凝集试验的敏感性、特异性及疗效考核价值。方法：检测用吡喹酮治疗前后７２例慢性血吸虫病患者和对照组的血清。结果：慢性血吸虫病患者血清阳性率９３．１％（６７／７２），血清循环抗原水平与每克粪便内虫卵数（ＥＰＧ）无明显相关，正常人血清假阳性率３．２％（３／９５），１０例华支睾吸虫病患者血清中有１例阳性，其他病患者１１例血清均阴性。血吸虫病患者治疗后３个月，粪检阴转者中８０．７％（４６／５７）血清抗原亦转为阴性，粪检阳性者血清抗原检测仍为阳性，所有阳性血清抗原滴度均较治疗前明显下降。结论：金黄色葡萄球菌Ａ蛋白协同凝集试验能用于血吸虫病诊断和疗效考核，并有简易、快速和费用低廉的优点。     

原发性肝细胞癌患者CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的频率、表型及功能

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T淋巴细胞（CD4^＋CD25^＋Treg）在HCC患者外周血及肿瘤组织中的频率、抑制功能及临床意义。方法收集18例原发性HCC患者的PBMC、肝癌组织及相应的癌旁组织标本,以及10例CHB患者和15名健康对照的外周血标本,以三色与四色流式分析法分析PBMC以及肿瘤浸润的淋巴细胞中CD4^＋CD25^＋Treg的频率及表型,并同时分析其与HBV持续感染、肿瘤TNM分期和其他临床指标的关系,用BrdU掺入法评价CD4^＋CD25^＋Treg的免疫抑制功能。结果与健康对照组相比HCC患者、慢性HBV感染者外周血中CD4^＋CD25^＋Treg频率明显上升（P＜0．01）,且HCC患者肿瘤浸润的淋巴细胞中CD4^＋CD25^＋Treg的频率也明显上调（P＜0．01）;随着肿瘤的进展HCC患者外周血中CD4^＋CD25^＋Treg呈上升趋势（P＜0．05）; HCC患者CD4^＋CD25^＋Treg可非特异性地抑制自身活化的CD4^＋CD25^- T淋巴细胞,并呈剂量依赖性,且抑制能力与健康对照组相比差异无统计学意义。结论HCC患者外周血中及肿瘤组织中CD4^＋CD25^＋Treg的频率升高,增多的CD4^＋CD25^＋Treg可能参与抑制抗HCC的免疫应答,从而使肝癌细胞逃脱机体的“免疫监视”作用。     

原发性肝癌患者细胞免疫功能变化及其与转归的关系

目的了解原发性肝癌(肝癌)患者细胞免疫功能变化及与临床转归的关系。方法应用流式细胞术检测22例肝癌患者T淋巴细胞亚群及CD8 T淋巴细胞CD28共刺激分子表达，酶联免疫吸附试验及放射免疫法检测血清白细胞介素-2(IL-2)、转化生长因子β1(TGFβ1)及白细胞介素-6(IL-6)水平，并与慢性乙型肝炎、肝硬化及正常对照比较。结果肝癌患者CD8 CD28-T淋巴细胞较正常增高，CD8 CD28 T淋巴细胞显著降低。肝癌、肝硬化及慢性乙型肝炎患者CD4 T淋巴细胞、CD4 ／CD8 比值、IL-2水平较正常明显降低，CD8 T淋巴细胞、IL-6、TGFβ1水平升高；肝癌患者CD4 T淋巴细胞、CD4 ／CD8 比值、IL-2水平低于慢性乙型肝炎，IL-6、TGFβ1水平高于慢性乙型肝炎及肝硬化患者；血清IL-6及TGFβ1水平与肝癌分期相关。结论肝癌患者存在明显的细胞免疫功能紊乱和抗肿瘤免疫功能低下，观察这些指标的变化对估价肝癌患者的抗肿瘤免疫功能以及预后将有帮助。【     

肝细胞肝癌中血管生成拟态的研究

目的探讨肝细胞肝癌（HCC）中是否存在血管生成拟态（VM），并进一步闸述VM存在的临床意义。方法收集99例手术切除并死于HCC临床资料和随访资料完整的病例，进行过碘酸雪夫氏反应（PAS）与CD31双重染色以及CD105、CD31、Hepatocyte免疫组织化学染色检测HCC中是否存在VM。结果12．12％（12／99）的患者HCC具有VM。Edmondson分级Ⅰ～Ⅱ级HCC中VM阳性率（2．5％）低于Ⅲ～Ⅳ级HCC中VM阳性率（18．64％）（x^2=4．416，P〈0．05）；VM组的国际癌症病期分期与无VM组的相比差异无统计学意义，但VM组更易于发生远处转移（x^2=8．873，P〈0．01）。Kaplan-Meier生存分析显示VM阳性组的生存率低于VM阴性组（P〈0．01）。结论HCC中存在VM，恶性度越高HCC形成拟态的能力越强。具有VM的HCC易发生转移，预后差。     

T淋巴细胞免疫功能重建对小鼠肝癌转移的影响

目的研究T淋巴细胞免疫功能重建对小鼠肝癌转移程度的影响,进一步探讨免疫对肝癌转移的影响因素,寻找肝癌转移的免疫干预手段。方法建立T淋巴细胞免疫功能重建的模型。将裸鼠分成高、低转移的T淋巴细胞免疫功能重建组和未重建组。取淋巴结通过病理切片观察转移程度。计算成瘤时间和生长速度的差异,检测肿瘤细胞株组织相容性复合物(MHC)Ⅰ、Ⅱ表达。应用Th1—Th2-Th3基因芯片检测不同转移潜能小鼠体内T淋巴细胞相关基因的差异。结果进行T淋巴细胞免疫功能重建后裸鼠外周血CD 3、CD4、CD 8和CD4/CD 8比例均高于未重建组;高、低转移潜能的肝癌细胞在裸鼠体内平均成瘤时间为(7.7±0.6)d,正常Balb/c小鼠为(11.5±1.3)d。高、低转移潜能肝癌细胞的肿瘤生长速度具有明显的差异。免疫重建后的裸鼠肿瘤淋巴结远处转移显著降低(P<0.0 5)。高转移组肿瘤细胞的M H C Ⅰ表达明显低于低转移组(P<0.0 5)。高转移组T淋巴细胞Th1/Th2相关基因的表达低于低转移组。结论免疫功能重建可以在一定程度上影响小鼠肝癌的转移。肿瘤M H C分子表达的改变和机体淋巴细胞T h 1/T h 2 相关基因的表达降低可能是影响肝癌转移潜能的原因。     

前S2合成肽对肝癌组织中浸润T淋巴细胞亚群表达的影响

目的通过前S2合成肽对肝细胞癌(HCC)组织中浸润T淋巴细胞亚群表达状况的分析,探讨前S2合成肽是否能改变乙型肝炎病毒(HBV)导致的HCC组织中浸润T淋巴细胞亚群表达的百分数和CD4+/CD8+比值,达到特异性治疗HCC. 方法用Merrifield固相化学合成法合成HBV中前S2抗原性最强的P120～146多肽段.测序后,用0.01mol/L磷酸盐缓冲液溶解除菌后作为抗原.选择12例术后病理诊断为HCC,术前血清经酶联免疫吸附法测得HBsAg、HBeAg、抗-HBC阳性和HBV DNA阳性,且HBsAg在HCC组织中表达为阳性病例作为研究对象.在96孔培养板上,每孔加入经密梯度离心获得的单个核细胞悬液100μl(1×106细胞),设每孔含量为1μg、5μg、10μg、白细胞介素-2 500U和阴性对照共5组,每组均设3复孔,作用7d后制片,采用APAAP法观察CD3+、CD4+、CD8+的百分数和CD4+/CD8+的比值变化. 结果 发现在含有前S2合成肽5μg/孔组中,CD4+表达明显增加(34.1±3.2),与自身对照(29.3±3.5)相比差异有显著性 (t＝3.508,P<0.01),CD4+/CD8+比值(1.19±0.43)与自身对照(0.81±0.41)相比差异有显著性(t＝2.235,P＜0.05).在白细胞介素-2组中,CD3+表达有增加,与自身对照相比有差异,其它各组T淋巴细胞亚群几乎处于不变化的状态. 结论在适当的剂量下,前S2合成肽能够改变HCC组织中T淋巴细胞亚群的表达,使CD4+增加,并能改变CD8+静息状态,使二者互为达到杀伤肿瘤细胞的目的,为特异性运用前S2蛋白提供客观依据.     

肝细胞癌Autotaxin cDNA部分序列测定及其意义

进行肝癌Ａｕｔｏｔａｘｉｎ（ＡＴＸ）ｃＤＮＡ部分序测测定,观察ＡＴＸ ｍＰＲＮＡ在肝癌组织中的表达程序,以探讨ＡＴＸ在肝癌转移机理中的作用。方法 提取肝癌７７２１细胞株,５例正常肝组织,３２肝癌组织ＲＮＡ,参照黑色素瘤ＡＴＸ ｍＲＮＡ表达程序分析,同时７７２１细胞株ＲＴ－ＰＣＲ产物进行ｃＤＮＡ序列测定显示与黑色素具有９９。７％的同样性;癌组织ＡＴＸ ｍＲＮＡ表达显著高于正常肝组织。结论 肝癌及正常     

肝癌的早期治疗

原发性肝癌发病率居世界恶性肿瘤第五位，每年新增人数约100万，死亡约60万。近年来随着影像技术及分子生物学的发展，肝癌的早期治疗也取得了长足进步。[第一段]     

KAI1基因对肝癌MHCC97-H细胞生长及侵袭能力的影响

KAI1基因是从前列腺癌中克隆的肿瘤转移抑制基因。用基因转染技术研究KAI1基因对肝癌细胞生长及侵袭能力的影响。     

肝癌临床研究之我见

原发性肝癌（大多为肝细胞癌）全球发病率高，我国占第一位，在我国癌症病死率中，肝癌占第二位，在全球占第三位。这个第一、第二和第三，提示我国肝癌研究的重要性和迫切性。     

肝癌的非手术治疗

肝癌患者病情复杂,宜根据病变的具体情况和各种治疗方法的不同特点和适应证选择最佳方案。治疗方法的选择应依据肿瘤的大小和数目、肿瘤侵袭的部位和范围、静脉癌栓和远处转移情况、患者肝功能代偿程度以及全身状况(年龄、心肺功