高迁移率族蛋白1对奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞凋亡的影响

目的 构建pDsRED2-HMGB1重组质粒,探讨转染高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对奥沙利铂诱导的SGC-7901细胞凋亡的影响.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HMGB1 mRNA全编码序列,将PCR产物插入到pDsRED2-N1载体的Xho I和EcoR I位点,构建pDsRED2-HMGB1重组质粒;通过脂质体法转染SGC-7901胃癌细胞,荧光显微镜检测HMGB1红色荧光融合蛋白表达.Western blot鉴定HMGB1蛋白表达.应用流式细胞仪(Annexin-V/PI标记)分析HMGB1过表达对奥沙利铂诱导胃癌细胞凋亡的影响.结果 成功构建真核表达质粒pDsRED2-HMGB1,转染SGC-7901细胞后,荧光显微镜下可见细胞内有HMGB1红色荧光融合蛋白的表达;流式细胞术检测发现转染pDsRED2-HMGB1后SGC-7901细胞凋亡水平较转染pDsRED2-N1组下降22.4%.结论 HMGB1过表达可抑制奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞凋亡.     

人HMGB1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的  构建人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因的原核表达载体,观察表达水平并纯化重组蛋白。方法  根据GenBank中人HMGB1基因序列,用OptimumGeneTM行密码子优化并合成目的基因,经PCR扩增,NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,插入原核表达载体pQE-T7-2的相应位点,构建原核表达质粒pQE-T7-2/HMGB1。经菌落PCR、酶谱分析及序列分析鉴定重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot印迹法鉴定重组蛋白,Ni NTA树脂亲和纯化目的蛋白。结果  成功构建人HMGB1克隆载体和表达载体;表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20%以上,Western blot法显示,重组蛋白能与抗HMGB1抗体和抗His抗体特异结合,亲和层析纯化后纯度达90%以上。结论  成功构建高效稳定的重组人HMGB1原核表达载体,获得纯化人HMGB1蛋白,为进一步研究HMGB1的功能奠定基础。     

乳源抗菌-免疫调节融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建乳铁蛋白抗菌肽(Lfcin B)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化.方法 采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白.用Glutathione Sepharose 4B亲和层析方法纯化融合蛋白.结果 成功构建原核表达质粒pGEX-KG-FP,并在大肠杆菌BL21中诱导其高表达.SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗GST单克隆抗体所识别的融合蛋白分子量与理论值相近.经Glutathione Sepharose 4B纯化后,得到较纯的GST-FP融合蛋白.结论 构建了原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该融合蛋白.     

人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

人HMGB1真核表达载体的构建及其在单核细胞的表达

目的构建人高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达载体,并探讨其免疫调节作用。方法从HMGB1克隆载体酶切分离HMGB1基因片段,插入增强型绿色荧光蛋白载体pCITE EGFP,菌落PCR和酶谱分析鉴定重组载体。重组表达质粒转染人单核细胞系（U937）,梯度G418筛选,荧光和Western blot检测HMGB1的表达。结果菌落PCR和酶谱分析显示目的基因被正确插入真核表达载体,获得重组质粒pCITE EGFP HMGB1,转染U937细胞随培养基中G418浓度的升高而增强,转染细胞中目的蛋白HMGB1表达量明显升高。结论成功构建重组载体pCITE EGFP HMGB1,并获得稳定表达人HMGB1的单核细胞系,为研究HMGB1对单核巨噬细胞的作用及其机制奠定基础。     

3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位

目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。     

小鼠重组釉蛋白基因稳定表达细胞系的建立

目的:构建小鼠重组釉蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系.方法:取初生小鼠牙胚组织,提取 RNA,用 RT-PCR 技术扩增釉蛋白基因片段,经双酶切后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1^TM/myc-His(-)B 上, 转化大肠杆菌E.coli DH5α, 中提质粒,将该重组表达质粒转染至 HEK 293A 细胞,用 G418 筛选出阳性克隆,并检测釉蛋白的表达水平.结果:通过测序表明,小鼠釉蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上.将该表达系统转染 HEK 293A 细胞后,进行 Western Blot 检测,证明其中有相对分子质量约 32 000 的釉蛋白表达.结论:成功构建了小鼠重组釉蛋白真核表达载体,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.     

BMP2基因转染犬牙髓细胞的实验研究

目的 构建骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)绿色荧光融合蛋白pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,然后再用其在体外转染犬牙髓细胞,探讨BMP2基因转染对牙髓细胞BMP2基因表达的影响,及是否表达BMP2蛋白.方法 构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,采用阳...     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

丙酮酸乙酯对滑膜细胞HMGB1的影响及机制

目的 探讨丙酮酸乙酯对类风湿关节炎（RA）滑膜细胞高迁移率族蛋白-1（HMGB1）表达的影响及分子机制.方法 将培养的RA滑膜细胞分为正常对照组、TNF-α组和丙酮酸乙酯＋TNF-α组;采用RT-PCR法检测细胞HMGB1 mRNA表达;ELISA法检测细胞培养上清液中HMGB1、IL-6和IL-8含量;采用Western blot法分别检测滑膜细胞胞质和核内NF-κB变化;采用免疫荧光法观察NF-κB在细胞中的分布.结果 丙酮酸乙酯可抑制TNF-α诱导滑膜细胞IL-6、IL-8、HMGB1的分泌和HMGB1 mRNA的表达,以及NF-κ B（p65）在滑膜细胞核内的表达和移位.结论 丙酮酸乙酯能下调滑膜细胞HMGB1表达和抑制NF-κB信号通路活化,可能对RA发挥抗炎作用.     

前列腺癌根治术后HMGB1表达的意义

目的调查HMGB1在人类前列腺癌细胞链中的表达及对前列腺癌根治术预后的影响。方法通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测前列腺癌细胞株DU-145、PC-3以及LNCaP和正常前列腺细胞株RWPE-1中HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。免疫组化法测定168例前列腺癌患者标本中的HM GB1蛋白表达水平。比较前列腺癌患者中HMGB1表达阳性和阴性组间的临床指标。探讨HMGB1蛋白的表达是否可以预测前列腺癌根治术后患者生化复发的危险性。结果三个前列腺癌细胞株DU-145、PC-3以及LNCaP与正常前列腺细胞株RWPE-1相比较,HM GB1的mRNA和蛋白表达水平都较高。前列腺癌根治术后患者的HM GB1蛋白表达阳性比率为60.1%（101/168）。标本中HMGB1蛋白表达阳性与患者的病理分期、Gleason评分、术前PSA和生化复发等因素相关。前列腺癌患者中HMGB1蛋白表达阳性相比于阴性其无生化复发生存时间较短（23.1 months vs.15.6 months）（P〈0.001）。HM GB1蛋白表达可以预测前列腺癌根治术后患者无生化复发的生存时间（hazard ratio=2.348,95%CI=1.373,6.361,P=0.001）。结论前列腺癌细胞株中HMGB1的mRNA和蛋白表达水平都较高,可能和前列腺癌的发病有关,可能作为一种新的瘤标预测前列腺癌根治术后生化复发的危险性。     

高迁移率族蛋白B1、基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子-C在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

目的研究甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）中高迁移率族蛋白B1（high mobility group box1,HMGB1）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）和血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF—C）的表达及与PTC临床病理特征的关系。方法应用免疫组化SP法和原位杂交技术联合检测58例PTC、20例甲状腺腺瘤、25例结节性甲状腺肿和10例正常甲状腺组织HMGB1、MMP-9、VEGF—C蛋白和HMGB1 mRNA的表达。结果HMGB1、MMP-9、VEGF-C蛋白和HMGB1 mRNA在PTC中的表达显著高于3种非癌组织（P〈0．05）。HMGB1、MMP-9蛋白和HMGB1 mRNA表达的阳性率与肿瘤的直径及淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。VEGF-C蛋白表达的阳性率与淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。HMGB1、MMP-9、VEGF—C蛋白和HMGB1 mRNA表达的阳性率与患者的性别、年龄无关（P〉0．05）。HMGB1、MMP-9和VEGF—C蛋白的表达均呈两两正相关（P〈0．05）,HMGB1蛋白与HMGB1 mRNA的表达也呈正相关（P〈0．05）。结论HMGB1、MMP-9、VEGF—C蛋白和HMGB1 mRNA的表达与PTC的发生发展及浸润、转移有关,检测其表达对判断临床进展及推测预后有一定参考价值。     

高迁移率族蛋白1在卵巢子宫内膜异位症中的表达及意义

【摘要】目的研究高迁移率族蛋白1（HMGBl）在卵巢子宫内膜异位症中的表达,为子宫内膜异位症的早期诊断、治疗及预后提供新的思路。方法采用RT—PCR和western—blotting检测HMGBImRNA和HMGBl蛋白在69例卵巢子宫内膜异位症患者异位子宫内膜和在位内膜及69例非子宫内膜异位症患者的在位内膜中（对照组）的表达情况。结果HMGBlmRNA在卵巢异位子宫内膜、在位内膜和非异位症的在位内膜均有表达,其表达灰度值分别为：0．5438±0．0565、0．3016±0．0614、0．1536±0．0444;HMGBl蛋白在三组内膜中表达的灰度值分别为：0．8399±0．0287、0．4010±0．0643、0．1999±0．0716。三组HMGBlmRNA、HMGBl蛋白的表达水平比较差异均有统计学意义（F=8．756,P〈0．05）。HMGBl在各组不同月经时期表达水平比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。卵巢子宫内膜异位症患者临床分期高级别异位内膜中HMGBl表达水平高于低级别者（t=10．28,P〈0．01）,与肿瘤大小、患者年龄无明显相关（P〉0．05）。结论HMGBl在卵巢子宫内膜异位、在位内膜中呈高表达,且临床分期级别越高其表达增强,其可能在卵巢子宫内膜异位症的发生、发展中起着重要的作用,可作为子宫内膜异位症的生物标记物。     

大黄素对内毒素激活后巨噬细胞释放HMGB1的影响

目的探讨大黄素对内毒素激活后巨噬细胞高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因表达和胞外释放的影响。方法内毒素脂多糖激活后小鼠腹腔巨噬细胞培养物经不同浓度（5、20、50μmol/L）大黄素作用一定时间,观察培养上清液HMGB1、TNF-α含量的变化及细胞HMGB1mRNA表达的改变。结果大黄素（50μmol/L）明显抑制脂多糖激活后小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1mRNA的表达和HMGB1、TNF-α的释放（均P（0.01）。结论大黄素具有抑制巨噬细胞HMGB1mRNA表达和HMGB1胞外释放的作用。     

鼠高迁移率族蛋白1A盒基因的克隆和原核表达

目的:克隆小鼠高迁移率族蛋白1A盒(HMGB1 A box)cDNA,并在大肠杆菌中表达GST-A盒融合蛋白。方法:从鼠肺提取总RNA,经RT-PCR获得HMGB1 A盒基因。将该基因插入pGEX-4T-2载体的BamHI和EcoRI位点之间并测序鉴定,转化BL21(DE3)后30℃IPTG诱导表达5h,进行SDS-PAGE分析。结果:DNA测序证明,获得了HMGB1 A盒基因,其序列与GenBank中报道序列基本一致。SDS-PAGE分析表明,HMGB1 A盒与GST融合蛋白获得成功表达,分子质量约36KD,表达量约占菌体总蛋白的15%,结论:通过RT-PCR成功克隆和表达了鼠HMGB1 A盒基因。     

HMGB1在大鼠重症胰腺炎损伤器官中的表达研究

目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）在牛磺胆酸钠诱导的大鼠重症急性胰腺炎（SAP）损伤后各组织的表达情况。方法将36只SD大鼠分为假手术对照组（n=18）、SAP组（n=18）,分别于24h、48h、72h三个时间点处死,每时间点6只。动物经胆胰管逆行注射5%牛黄胆酸钠诱发SAP,对照组以生理盐水代替5%牛黄胆酸钠行假手术。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法（S-P）检测大鼠不同组织（胰腺、肝脏、胃肠道、肺脏和肾脏）的HMGB1表达情况。结果 HMGB1在假手术组大鼠的胰腺、肝脏、胃肠道、肺脏和肾脏各组织中表达很弱甚至不表达。HMGB1在SAP大鼠上述组织中存在不同程度表达增高：①除胰导管外,胰腺腺泡和胰岛周围HMGB1表达增高;②胃肠道HMGB1在3个不同时间点均明显升高,主要表达的部位集中于黏膜深部;③在不同时间点肝细胞HMGB1轻度增高,但其它部位细胞未见表达异常;④肺支气管上皮HMGB1在24h时间点轻度增高,48h、72h达到表达高峰;⑤肾脏远曲小管HMGB1在SAP不同时间点表达增高。结论本研究结果表明HMGB1可能参与牛磺胆酸钠诱导的大鼠SAP的发病过程,而血清中增高的HMGB1可能由这些受损的器官组织产生和释放。     

新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析,为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条,运用MEGA5．2．1软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化;应用Excel表格对氨基酸构成进行计算;运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别,系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成,系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株,并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后,这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。     

CD44、NFYB及HMGB1基因表达与乳腺癌术后复发关系的研究

目的 研究黏附分子CD44、核转录因子Y,β（NFYB）及高迁移率蛋白B1（high-mobility group box-1,HMGB1）基因表达与乳腺癌术后复发转移的关系,初步探讨其在判断乳腺癌预后的价值.方法 81例乳腺癌患者入选,其中41例术后5年随访期内出现复发者为研究组;40例未复发仍存活者为对照组.提取所有病例石蜡包埋组织RNA,质量鉴定后,应用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）芯片技术检测CD44 、NFYB及 HMGB1基因的表达,分析2组间基因表达差异,进行多因素分析.结果 研究组与对照组相比较,CD44 、NFYB及 HMGB1基因表达有差异,表达上调（P〈0.05）.将基因表达与术后复发时间进行COX分析,结果显示CD44 基因表达与乳腺癌术后复发时间具有负相关（B=-0.042,Exp（B）=0.959）,NFYB及HMGB1基因表达与乳腺癌术后复发时间无相关性,结果无统计学意义.结论 CD44 、NFYB及 HMGB1基因在乳腺癌术后复发组和未复发组中差异表达;基因CD44 过表达是乳腺癌预后差的指标之一,进一步研究可为预防和控制乳腺癌的复发提供新线索.     

活化T细胞核因子2 可抑制高迁移率蛋白1 的释放

目的探讨活化T细胞核因子2（NFAT2）对炎症因子高迁移率蛋白1（HMGB1）释放的抑制效应。方法观察脂多糖刺激可
增加HMGB1向胞外释放,在脂多糖刺激的不同时间点收集细胞及其培养上清,应用蛋白印迹法及酶联免疫法检测细胞内及培
养上清中HMGB1蛋白水平的变化;另一方面,探讨脂多糖刺激对NFAT2与HMGB1在胞浆中的结合的影响,在脂多糖刺激的
不同时间点收集THP-1细胞,提取蛋白后应用免疫共沉淀观察二者的结合情况;应用小RNA干扰技术抑制NFAT2的表达,检测
对HMGB1 合成释放的影响。结果脂多糖刺激THP-1 细胞时间越长,细胞培养上清的HMGB1 浓度增加,而细胞浆内与
NFAT2 结合的HMGB1 水平下降,细胞核内没有检测到二者的相互作用。NFAT2 的小RNA干扰质粒转染后,THP-1 细胞内
NFAT2浓度下降,同时细胞上清中HMGB1的水平上升。结论NFAT2可抑制HMGB1的合成释放。