胆管结扎与再通对大鼠肝内细胞表型和NOX4蛋白表达的影响

目的设计并建立胆管结扎及结扎后再通的大鼠肝纤维化模型,观察胆管结扎及再通对大鼠肝组织内细胞上皮-间质表型
和氧化应激相关蛋白表达的影响。方法12只雄性Wista大鼠随机分为假手术组、胆管结扎2周组、胆管结扎4周组和胆管结扎
2周后再通2周组,通过组织HE染色、Masson染色等方法评估模型大鼠肝纤维化病变程度;通过免疫组化和Western blot等方法
并检测上皮、间质标记蛋白及氧化应激相关蛋白的表达情况。结果相较于假手术组,随着胆管结扎时间的延长,模型组大鼠肝
纤维化明显加重,α-SMA、collagen I、NOX4和Vimetin等蛋白表达显著升高,而E-cadherin表达则明显降低;结扎后再通组大鼠
肝纤维化较单纯胆管结扎4周组大鼠明显减轻,NOX4及间质细胞标记蛋白表明显低于单纯结扎4周组,内皮细胞标记蛋白表
达较单纯结扎4周组则显著升高。结论胆管结扎可上调大鼠肝内间质表型相关蛋白及NOX4蛋白的表达,同时抑制上皮表型
相关蛋白的表达;当实施再通手术后,原胆管结扎大鼠肝内上皮表型相关蛋白表达增加,而间质表型相关蛋白及NOX4蛋白的
表达明显减少。
     

上皮间质转化在人胚胎肝胆管板发育过程中的发生情况及其意义

目的 观察上皮间质转化(EMT)标记物在人胚胎肝胆管板发育过程中的表达,探讨胆管板发育过程中EMT的发生和意义。方法 应用免疫组化法观察EMT相关标记物细胞角蛋白19(CK19)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在31例8~40周龄人胚胎肝胆管板发育过程中的表达和变化情况。结果 从8周龄开始,随着胆管板阶段、胆管板重新塑形阶段、胆管形成阶段的发展,汇管区内CK19染色阳性细胞百分率也逐渐增加,而vimentin和α-SMA阳性细胞百分率则逐渐减少,CK19染色阳性细胞百分率分别与vimentin和α-SMA阳性细胞百分率呈负相关(CK19与vimentin:r=-0.820,P<0.001;CK19与α-SMA:r=-0.797,P<0.001)。9周龄胚胎肝胆管板细胞开始表达vimentin,13~19周时达到高峰,之后减少,28周时检测不到;14~32周龄胚胎肝部分发育中的胆管细胞也表达vimentin,观察到汇管区vimentin阳性的肌纤维母细胞(pMFs)向胆管(板)内整合、移行。通过连续切片观察到9~32周龄胚胎肝部分胆管板或胆管细胞共表达vimentin和CK19。结论 人胚胎肝胆管板发育过程中存在间质上皮转化,与胆管形成有关。     

肝内胆管结石和胆管炎的兔模型

目的应用胆总管部分梗阻加感染法建立模型,观察肝胆管结石成石情况、胆管和肝组织的病理变化。方法将胆总管结扎至1.45mm粗细,注入动物标准致病菌O157K88大肠杆菌液2.5×104菌株/kg,术后3周、5周、7周取材,观察肝叶质量变化,肝胆管成石情况,做HE、VG染色。结果受累肝叶萎缩纤维化,未累及的肝右叶代偿肥大;建模3周胆管成石率为87.5%,胆囊成石率为75.0%,5周、7周成石率全部为100%,各兔形成结石数量多少不等。3周时胆管上皮坏死脱落,有黏膜下小脓肿形成,管壁周围大量中性粒细胞浸润,肝细胞肿胀,空泡样变性,汇管区炎性细胞浸润,呈急性化脓性胆管炎改变;5周时上皮细胞增生,壁内壁外见黏液细胞增生,胆管腔内见脱落上皮细胞和蓝染的结石,壁周纤维结缔组织增生,仍有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润,肝细胞空泡样变性,汇管区纤维结缔组织增生,肝小叶结构破坏;7周时胆管上皮增生增厚更加明显,壁内外黏液细胞增多,胆管壁纤维增生,汇管区纤维结缔组织增生,间隔增宽,肝细胞数目减少,肝小叶破坏,有假小叶形成,呈慢性增生性胆管炎改变。结论量化胆总管梗阻程度和细菌量建立模型成功率高,成石率高。肝内胆管结石是以慢性增生性胆管炎为病理学基础的。     

血小板衍生生长因子在梗阻性黄疸鼠肝中的免疫组化分析

通过大白鼠胆总管结扎模型，研究血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）在肝内的免疫组化定位，探讨ＰＤＧＦ在梗阻性黄疸肝纤维化中的作用。实验结果：胆总管结扎２ｗ后肝小叶汇管区有明显的间质细胞和胆管增生及肝纤维化，胆总管结扎４ｗ导致肝硬变形成；肝脏ＰＤＧＦ－Ｂ链免疫组化染色显示胆总管结扎２ｗ后肝间质细胞和胆管上皮细胞呈阳性染色反应。表明ＰＤＧＦ在肝间质细胞增生、产生大量细胞外基质的过程中起重要作用，与胆道梗阻所致肝纤维化、肝硬变有关。     

猪血清攻击后肝纤维化大鼠α-SMA、TIMP-1 在肝组织内持续表达

目的猪血清法肝纤维化模型中,致纤维化因子停止作用于肝脏后α-SMA、TIMP-1阳性HSCs表型与组织中I型胶原表达的相关性。方法猪血清10周法制作大鼠肝纤维化模型,于造模6周、10周、14周和20周,免疫组织化学观察α-SMA、I型胶原,肝组织原位杂交法检测TIMP-1阳性表型HSCs在肝组织中的分布,计算机图像分析系统测定阳性比率,SPSS11.0分析各参数在肝纤维化进程中相关性。结果α-SMA于造模第6周、10周即有表达,主要分布于汇管区血管或中央静脉内膜下。于造模第14周、20周时持续表达。TIMP-1于造成模第6周时,表达也限于汇管区血管和中央静脉内膜下。造模第10周、14周时阳性表达率明显增加,向肝组织内伸展,并持续维持高阳性表达至造模第20周。α-SMA和TIMP-1在造模过程中随肝纤维化的进程呈显著正相关（r=0.989,P=0.000）,二者分别与Ⅰ型胶原呈显著正相关（r=0.893,P=0.000;r=0.923,P=0.000）。结论猪血清攻击法肝纤维化大鼠模型中,致纤维化因子启动肝纤维化进程,但不随致纤维化因子的终止而终止。所以,抗肝纤维化治疗成为治疗本病的关键。     

胆管结扎诱导的肝纤维化大鼠肝脏上皮间质表型的变化

目的观察胆管结扎诱导肝纤维化大鼠肝细胞是否发生上皮间质表型变化。方法 24只Wistar大鼠分为假手术组和胆管结扎组,运用HE及Massion染色检测肝纤维化变化;免疫印迹方法检测大鼠肝脏中上皮标志E-钙蛋白、白蛋白和I型胶原、波形蛋白的表达;采用免疫荧光双染的方法检测成纤维细胞特异性蛋白(FSP-1)+波形蛋白;FSP-1+I型胶原;FSP-1+白蛋白;白蛋白+I型胶原等蛋白在细胞中的定位。结果胆管结扎组大鼠的ISHAK纤维化评分(4.42±1.16 vs 0.00±0.00,P=-0.000),METAVIR纤维化评分(3.42±0.67 vs 0.00±0.00,P=-0.000)及Massion染色中胶原含量(0.30±0.06 vs 0.11±0.07,P=-0.000)较假手术组明显增高。与假手术组相比,胆管结扎组中上皮标志白蛋白(0.53±0.63 vs 1.12±0.01,P=0.000)、E-钙蛋白(0.21±0.01 vs 0.44±0.01,P=0.000)明显减少,而I型胶原(8.21±0.12 vs 0.24±0.01,P=-0.000)、波形蛋白(3.14±0.01 vs 0.37±0.01,P=0.000)显著增高。胆管结扎组中共表达FSP-1+波形蛋白、FSP-1+I型胶原、FSP-1+白蛋白、白蛋白+I型胶原的细胞较假手术组明显增多。结论在胆管结扎组诱导的肝纤维化大鼠肝脏中上皮标记减少,间质标志增加,提示有部分上皮细胞可能发生了上皮间质表型转化。     

血小板衍生生长因子在梗阻性黄疸鼠肝中的免疫组化分析

通过大白鼠胆总管结扎模型，研究血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）在肝内的免疫组化定位，探讨ＰＤＧＦ在梗阻性黄疸肝纤维化中的作用。实验结果：胆总管结扎２ｗ后肝小叶汇管区有明显的间质细胞和胆管增生及肝纤维化，胆总管结扎４ｗ导致肝硬变形成；肝脏ＰＤＧＦ－Ｂ链免疫组化染色显示胆总管结扎２ｗ后肝间质细胞和胆管上皮细胞呈阳性染色反应。表明ＰＤＧＦ在肝间质细胞增生、产生大量细胞外基质的过程中起重要作用，与胆道梗阻所     

七叶皂苷钠通过降低4EBP1的磷酸化水平抑制梗阻性黄疸大鼠小胆管增生

目的 探讨七叶皂苷钠对梗阻性黄疸大鼠增生胆管的抑制作用.方法 81只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组:单纯胆管结扎组(n=36)、七叶皂苷钠组(n=27)、假手术组(n=18).胆管结扎术后24h开始第1次腹腔注射给药,连续给药7d后,获取各组大鼠肝脏组织.HE染色观察肝脏组织形态结构,Masson染色观察肝脏组织胶原纤维增生情况,免疫荧光染色观察各组大鼠肝脏组织Ⅰ型胶原纤维(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原纤维(COL-Ⅲ)的增长,免疫组化染色检测相关蛋白的表达.结果 七叶皂苷钠可以改善梗阻性黄疸大鼠引起的肝纤维化,抑制COL-Ⅰ、COL-Ⅲ以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,减少大鼠肝脏汇管区周围小胆管增生以及胆管细胞内磷酸化真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(p-4EBP1)的表达.结论 七叶皂苷钠可以通过降低真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的表达抑制梗阻性黄疸大鼠的小胆管增生.     

LPS刺激SD大鼠胆管上皮细胞表型转化的动物实验研究

目的:探讨上皮标志物上皮性钙粘附蛋(E-cadherhin)和间叶标志物波形蛋白(Vimentin)在脂多糖(Lipopolysacoharides,LPS)诱导的SD大鼠胆管上皮细胞中的表达及其意义.方法:选用SD大鼠作为研究对象,用LPS(2μg/ml)刺激其胆管,用免疫组化方法检测E-cadherin和Vimentin在胆管细胞中的表达情况.结果:SD大鼠胆管上皮细胞经LPS刺激后,E-cadherin蛋白表达逐渐缺失(P＜0.05),而Vimentin蛋白出现阳性表达(P＜0.05).结论:LPS刺激可使SD大鼠胆管上皮细胞发生上皮细胞间质转型(Epithelial-mesenchymal transitions,EMT).     

原位检测大鼠肝癌发生过程中端粒酶活性

目的　在大鼠实验性肝癌发生过程中原位显示端粒酶及其变化。方法　用含 0 .0 5 % 3′ 甲基 4 二甲基氨基偶氮苯的玉米粉喂饲大鼠 12周以制备肝癌模型。组织冰冻切片酶催化端粒延伸 PCR(原位TRAP)法检测端粒酶活性。结果　正常肝细胞、胆管细胞以及汇管区细胞一般均阴性。肝纤维化、早期肝硬化病变中一小部分肝细胞呈弱阳性 ,间质内增生的肌纤维母细胞端粒酶活性较强 ,增生的胆管细胞和结节状增生肝细胞显示弱至中等强度酶活性。不典型增生的胆管细胞及肝细胞内可见较强的酶活性。肝细胞性肝癌和胆管细胞性肝癌中绝大部分癌细胞可见端粒酶表达 ,但强弱不一。上述端粒酶活性一般位于细胞核内。结论　大鼠肝癌发生过程中端粒酶活性逐渐增加提示该酶对肿瘤细胞获得永生化特性具有重要意义。     

胆汁淤积性肝硬化大鼠模型的改良

目的构建肝纤维化大鼠模型,并对经典结扎胆总管(BDL)复制模型方法进行适当改进。方法 80只SD雄性成熟大鼠,按随机数字表法分为A组40只、B组40只,分别运用胆总管结扎法和肝门部肝总管缝扎法先后两次造模,各取其中10只为假手术组进行对照,术后1周眼眶取血采用酶联免疫吸附法检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、白蛋白/球蛋白(A/G),术后4周HE染色观察大鼠肝组织病理学变化,采用免疫组化染色分析肝脏组织α-SMA和CK-19表达水平。结果两种方法均表现出明显肝功能损害;标本胆小管增生明显,肝脏假小叶形成,达到早期肝硬化,肝脏α-SMA和CK-19表达水平明显升高,胆总管结扎组死亡率为66.7%,肝门部肝总管缝扎组死亡率为26.7%。结论肝门缝扎法可成功建立胆汁淤积性肝硬化大鼠模型,能够明显降低模型动物死亡率,提高模型质量及实验效率。     

腹腔持续注射血管紧张素(-1-7)对胆管结扎大鼠肝纤维化的抑制作用

目的探讨血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]对胆管结扎(BDL)大鼠肝纤维化的抑制作用。方法 18只Wister雄性大鼠随机分为假手术(SHAME组)组,BDL组和Ang-(1-7)治疗组。假手术组:行开腹术再关腹,在腹腔埋注射泵,以25μg.kg-1.h-1的速度持续注射生理盐水;BDL组:开腹结扎胆总管建立肝纤维化模型,在腹腔埋注射泵,以25μg.kg-1.h-1的速度持续注射生理盐水;Ang-(1-7)治疗组:BDL建立肝纤维化模型,同时在腹腔埋注射泵,以25μg.kg-1.h-1的速度持续注射Ang-(1-7)。4周后宰杀动物、取肝组织,行Masson胶原染色,肝纤维化评分,测定羟脯氨酸含量,免疫组织化学检测α-肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果与BDL组相比,Ang-(1-7)治疗组肝纤维化评分(2.33±0.52 vs 5.17±0.75)、胶原面积(23.71±3.43 vs 89.77±9.92)、羟脯氨酸含量(0.36±0.03 vs 0.52±0.04)、α-SMA的表达(54.11±17.55 vs 191.84±31.72)均减少,有统计学意义(P<0.01)。结论Ang-(1-7)对胆总管结扎所致的肝纤维化具有抑制作用。     

梗阻性黄疸大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白和肿瘤坏死因子-α的表达

[目的]探讨梗阻性黄疸大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达及其意义.[方法]采用胆总管结扎法建立梗阻性黄疸大鼠模型,4周后检测大鼠肝组织羟脯氨酸、透明质酸和层黏连蛋白的含量,观察肝组织的病理变化,并采用免疫组织化学染色方法观察大鼠肝组织中TNF-α和HSC标志物-αSMA的表达情况.[结果]胆总管结扎组与假手术对照组比较,大鼠肝组织中羟脯氨酸、透明质酸和层黏连蛋白的含量均明显增高,肝组织内可见大量胆管及纤维组织增生,纤维间隔形成,多数大鼠形成胆汁性肝硬化.胆总管结扎组大鼠肝组织内-αSMA阳性细胞主要分布在增生的胆管周围、纤维组织及间隔内,TNF-α阳性表达的肝细胞呈散在分布.[结论]梗阻性黄疸大鼠肝组织中羟脯氨酸、透明质酸和层黏连蛋白含量明显升高,可见TNF-α在肝细胞中表达,而TNF-α及α-SMA阳性细胞的分布特征不相同.     

CD24 通过调节肝内Ly6Clo 巨噬细胞亚群中PDGF-B 的 分泌抑制肝纤维化进程

目的:探讨CD24 分子在胆总管结扎（BDL）诱导的小鼠胆汁淤积型肝纤维化中对肝内Ly6Clo巨噬细胞亚群的调节以及 分泌PDGF-B的影响。方法:建立小鼠胆总管结扎诱导的肝纤维化模型,将野生型（WT）与CD24 基因敲除（CD24-/-）雌性小鼠随 机分为造模组（BDL）与假手术组（Sham）,每组5只,造模组进行胆总管结扎,假手术组与造模组手术处理相同但不结扎胆总管。 术后7 d 应用HE 和天狼星红（Sirius Red）染色分析小鼠肝组织病理变化和肝纤维化程度,定量-PCR（Q-PCR）和Western 印迹 检测肝内α-SMA 等纤维化因子的表达,流式细胞术分析CD24 分子在肝内巨噬细胞亚群中的表达,共培养实验检测肝内星状 细胞中纤维化因子的变化。结果:两种基因背景小鼠的假手术组无病理表现,在造模组中,CD24-/-小鼠与WT 小鼠相比肝纤维化 明显加重,表现为肝汇管区炎性细胞浸润增多,α-SMA 等肝纤维化标志物的表达升高。流式分析结果显示,CD24 分子在肝内 Ly6Clo 巨噬细胞亚群上高表达,在造模组中,CD24-/-鼠造模后肝内Ly6Clo 巨噬细胞亚群比例[（65.05±0.250）%]高于WT 鼠 [（52.55±2.950）]%,差异有统计学意义（P<0.05）。进一步研究发现:PDGF-B 在肝内Ly6Clo巨噬细胞亚群高表达,并且在CD24-/- 小鼠中的表达明显高于WT小鼠,差异有统计学意义（P<0.000 1）。结论:CD24分子可通过调节肝内Ly6Clo巨噬细胞亚群中PDGFB 分泌减缓肝纤维化进程。     

维生素D受体激活对小鼠胆管结扎所致肝纤维化的影响及其机制

目的：探讨维生素D受体（VDR）激活对胆总管结扎（BDL）诱导小鼠肝纤维化的保护作用,并阐明其作用机制。方法：将60只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、假手术后给药组、模型组和治疗组,每组15只。假手术组小鼠开腹但不结扎胆总管,模型组小鼠双线结扎胆总管并中间离断,假手术后给药组和治疗组小鼠手术前3 d腹腔注射VDR激动剂帕立骨化醇（200ng·kg^-1,每周3次）,术后继续给药5 d。术后第5天取小鼠肝脏,采用HE染色和天狼猩红染色观察小鼠肝组织病理形态表现和肝纤维化程度。二氢乙啶（DHE）染色检测小鼠肝组织活性氧（ROS）水平。Western blotting法检测小鼠肝组织中沉默交配型信息调节3（Sirt3）、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（OGG1）、α-平滑肌蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）表达水平。结果：HE染色,假手术组和假手术后给药组小鼠肝细胞形态结构完整,无炎性细胞浸润;模型组小鼠组织中出现大量浸润的炎性细胞、点状样灶状坏死区,在肝小叶之间出现条索状的胶原沉积;与模型组比较,治疗组小鼠肝组织坏死灶面积明显缩小,炎症细胞浸润明显改善。天狼猩红染色,假手术组和假手术后给药组小鼠肝组织中仅大胆管周围存在少量的纤维化;模型组小鼠肝组织汇管区胶原沉积明显;与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中胆管周围胶原沉积减少。DHE染色,假手术组和假手术后给药组小鼠肝组织中,仅在汇管区存在少量的红色荧光;模型组小鼠肝组织中,汇管区及大胆管周围呈现出明显增多的红色荧光;与模型组比较,治疗组小鼠红色荧光的强度降低。Western blotting法检测,与假手术组和假手术后给药组比较,模型组小鼠肝组织中Sirt3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中Sirt3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论：VDR激活通过上调Sirt3蛋白降低氧化应激导致的肝星状细胞（HSC）激活,缓解胆汁淤积性肝纤维化。     

Antioxidant Effect of Sepia Ink Extract on Extrahepatic Cholestasis Induced by Bile Duct Ligation in Rats

Objective The aim of our study was to assess the complications of hepatic fibrosis associated with bile duct ligation and the potential curative role of sepia ink extract in hepatic damage induced by bile duct ligation.
Methods Rattus norvegicus rats were divided into 3 groups: Sham-operated group, model rats that underwent common bile duct ligation (BDL), and BDL rats treated orally with sepia ink extract (200 mg/kg body weight) for 7, 14, and 28 d after BDL.
Results There was a significant reduction in hepatic enzymes, ALP, GGT, bilirubin levels, and oxidative stress in the BDL group after treatment with sepia ink extract. Collagen deposition reduced after sepia ink extract treatment as compared to BDL groups, suggesting that the liver was repaired. Histopathological examination of liver treated with sepia ink extract showed moderate degeneration in the hepatic architecture and mild degeneration in hepatocytes as compared to BDL groups.
Conclusion Sepia ink extract provides a curative effect and an antioxidant capacity on BDL rats and could ameliorate the complications of liver cholestasis.