人骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探索体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法并观察基本生长特性，为今后研究其分化提供实验依据。方法：采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离人骨髓间充质干细胞，体外培养扩增，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期。结果：密度梯度离心法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞，细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状，48h后细胞开始贴壁，4-5d可见有集落形成，2w左右可达到基本融合。生长曲线示骨髓间充质干细胞增殖活跃，流式细胞仪检测显示约有86％的细胞处于G0、G1期。结论：人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下生长性状稳定，增殖能力较强，可作为肝组织工程中理想的种子细胞来源。     

人脂肪源性间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:分离培养并鉴定人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC).方法:采用贴壁法从人脂肪组织分离获得hAD-MSC,并从表面分子表达和定向分化两个方面进行鉴定.结果:成功从脂肪组织中分离获得间充质干细胞,该群细胞贴壁生长,形态类似成纤维细胞样;具有较强的体外增殖能力和自我更新能力;一致性好,纯度高,99％的细胞阳性表达CD105、CD90、CD13、CD44分子;CD117、CD34、CD45和HLA-DR阴性表达,阳性率低于2％;可向脂肪和成骨细胞定向分化.结论:分离所得细胞符合间充质干细胞基本特点,可确定为hAD-MSC.     

人脐血间充质干细胞分离培养的研究进展

干细胞是一类具有自我复制能力和产生分化细胞能力的细胞,分为胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）属于成体干细胞的一种,来源于胚胎发育早期的中胚层和外胚层,最早在骨髓（bone marrow,BM）中被发现。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

人胎肝来源间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的建立人胎儿肝脏非实质间充质干细胞(nonparenchymal mesenchymal stem cells, NPMSCs)的分离、培养和鉴定方法.方法采用体外细胞分离培养技术,分离培养人胎儿NPMSCs,用显微摄相、MTT和图像分析研究其增殖及生长特征,用流式细胞仪和免疫组织化学鉴定其表型.结果每个胎儿肝脏可获得(10 000±2 000)个贴壁细胞,但其中常混有5%～10%的其它肝非实质细胞,可见5～10个高速增生的细胞集落.原代和传代培养均生长缓慢,按1分3传代,传1代需8～10 d,细胞经传代后逐渐纯化,传10代后可达到109个细胞.NPMSCs不表达CD34,而表达CD166.传代NPMSCs表达微量AFP,不表达ALB.结论肝非实质细胞中含有NPMSCs,可成为种子细胞.传代培养NPMSCs在普通培养条件下不向肝细胞分化.     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

猴骨髓间充质干细胞的分离及多向诱导分化

目的　探讨猴骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外生长特性及多向分化潜力 .方法　以Percoll(质量密度 10 73g·L-1)非连续密度梯度离心分离出骨髓悬液中的MSCs,在非诱导条件下进行培养 ,观察细胞的形态、生长状况 .取原代体外培养3wk的MSCs分别向成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞及成肌细胞方向诱导 ,观察其诱导分化结果 .结果　原代培养的MSCs增殖缓慢 ,细胞增殖率和形态分化不均一 ,在培养过程中有多种形态的细胞出现 ,如伸展及增殖均不明显的圆形细胞 ,伸展充分但增值不明显的片状细胞、神经元样细胞 ,还可见增殖明显的克隆团状或条带状细胞群出现 .传代培养的MSCs细胞仍可见增殖情况及形态分化的多样性 ,但有“拉网”现象出现 .所培养的MSCs经诱导可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞发展分化 .结论　体外培养的猴MSCs细胞具有形态分化、增殖情况多样性的特点 ,并具有多向分化潜能 .     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的改良

目的探讨一种新的能提高脐血间充质干细胞体外分离培养成功率的方法。方法利用Ficoil分离脐血,采用改良的密度梯度两步离心法分离脐血单个核细胞,接种于含20％胎牛血清和5％人脐血血清的原代培养液中,在倒置相差显微镜下进行形态观察,直接免疫荧光法检测人脐血间充质干细胞相关抗原CD29的表达。加入成骨诱导剂体外诱导脐血间充质干细胞10d碱性磷酸酶染色鉴定其成骨分化能力。结果本实验方法成功分离培养出人脐血间充质干细胞。原代培养第4天即可见到有成纤维样细胞贴壁,10d左右集落形成,约25d进行传代。传代后生长加速,一周左右即可长满,免疫荧光检测显示脐血间充质干细胞相关抗原CD29呈阳性表达,成骨诱导10d碱性磷酸酶染色阳性。结论利用改良的密度梯度离心法可获得人脐血间充质干细胞．     

人骨髓间充质干细胞的分离培养

选择适宜的种子细胞是骨组织工程学研究中的主要问题。干细胞是近年来研究的热点，骨髓中除造血干细胞外，还含有另一类干细胞一间充质干细胞（mesenchymal stem cell MSC），在不同的诱导条件下，具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞等分化的能力。     

人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法。方法采用低速旋转-胰蛋白酶-胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）,采用免疫细胞化学和流式细胞术分析其表型特征,使用含10％FBS低糖-DMEM培养基培养。结果从羊膜分离的hAMSCs数为（6．72±1．21）×10^7/份（n=12）,所分离的kAMSCs明显表达间充质细胞标志物波形蛋白,不表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,高表达CD29和CD44。培养10天hAMSCs数量可增殖167倍。结论建立了人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法,hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向神经细胞分化的潜能。方法体外培养人BMMSCs,并诱导其向神经细胞分化。诱导前后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞类型,流式细胞术检测细胞周期以确定细胞增殖活性。结果分离培养的BMMSCs有克隆增殖能力。诱导后,分化细胞呈现典型神经元的表型,且免疫荧光染色呈NSE阳性。流式细胞术分析显示诱导前BMMSCs的增殖指数(PI)较高,细胞增殖活跃。与诱导前比较,诱导分化细胞的PI显著降低(P<0.01),细胞增殖发生抑制,而分化阶段各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMMSCs可以在体外增殖扩增,并能分化为神经元样细胞,且分化的神经元样细胞能较长时间存活。     

人羊水干细胞的分离培养及鉴定

目的：分离培养人羊水干细胞（ hAFSC ）并鉴定。方法：使用贴壁法分离培养羊水干细胞,细胞免疫荧光法和Western blot鉴定hAFSC。结果：分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105。结论：成功分离及培养hAFSC,可作为种子细胞用于干细胞移植治疗肝纤维化。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定

 目的 探索一个高效分离和扩增人骨髓间充质干细胞的方法,并通过形态学和多向分化能力进行鉴定。方法 抽取人胸椎骨髓标本,联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离MSCs,体外扩增后传代,相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记CD13、CD29、HLA-2、CD34、CD45和HLA-DR。在地塞米松、左旋VitC、b-磷酸甘油、FK506作用下向成骨细胞诱导分化;在TGF-beta 3、重组人胰岛素、丙酮酸钠、亚硒酸等作用下向软骨细胞诱导分化;在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化;在VEGF、bFGF作用下向血管内皮细胞分化。结果 原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好。细胞表面标记物CD13、CD29,HLA-2阳性,CD34、CD45 和HLA-DR阴性。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的表型特征。结论 该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,能成功定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞。     

人羊膜来源间质干细胞的分离、培养及鉴定

目的:探讨来源于人羊膜间质干细胞(amniotic-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)的分离、培养及鉴定.方法:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,加入胰酶37℃消化30 min,共2次,然后加入终浓度1.0 g/L的胶原酶和0.1g/L的DNA酶,37℃消化60 min,收集细胞,用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基进行培养和纯化.倒置显微镜观察细胞形态,取4～6代的细胞用流式细胞仪分析细胞表面标志,取扩增第3代后的AD-MSCs加入全反式维甲酸(RTRA)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)向神经元样细胞诱导分化.结果:来源于羊膜的细胞种植于DMEM/F12培养基中后,可在体外大量扩增并纯化;流式细胞检测显示:CD29、CD44、HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45、HLA-DR阴性表达.免疫细胞化学显示AD-MSCs经RTRA和bFGF诱导后表达神经元特异性烯醇化酶,不表达胶质纤维性蛋白.结论:羊膜中存在间质干细胞,其可以在体外培养、扩增、纯化,并可在体外向神经元样细胞分化.     

人羊膜间充质细胞的分离培养及向胰岛样细胞诱导分化

目的分离培养人羊膜间质细胞(hAMCs),初步探讨其向胰岛样细胞的诱导分化。方法羊膜组织经胰蛋白酶消化去除上皮细胞后,采用胶原酶I联合中性蛋白酶的方法分离hAMCs。细胞免疫荧光检测分离得到细胞表面标记Vimen-tin+,SSEA-4+表达;流式细胞仪检测CD29,CD90及CD34,CD45表达;RT-PCR检测ACTG2、ACTA2、MMP2、Cripto、Sox2、LEFTYA、nanog、Oct-4基因表达;添加诱导因子诱导hAMCs向胰岛样细胞分化。结果分离得到的hAMCs可体外长期传代,并保持稳定的遗传学特性;细胞表现vimentin+、SSEA-4+;CD29、CD90表达量分别为91.5%±9.93%和48.7%±9.47%;不表达CD34,CD45;表达ACTG2、ACTA2、MMP2和Cripto、Sox2、LEFTYA、nanog、Oct-4等基因。诱导后的细胞表达insulin、PDX1、ngn3、glucagon等基因,并表现insulin+。结论建立了人羊膜间充质细胞的分离培养方法;在体外可诱导分化为胰岛样细胞。     

人羊膜间充质干细胞的研究进展

人羊膜间充质干细胞(hAMSC)具有来源丰富、分离简单的优点。hAMSC在组织修复中具有支持造血、再生、免疫调节、抗纤维化等作用。本文对羊膜间充质干细胞在各个系统疾病治疗的研究进行了综述,旨在为羊膜间充质干细胞的应用提供参考。     

羊水中多能性干细胞的培养及分化

羊水中存在多能性干细胞,它们不仅阳性表达胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)表面标志物,如SSEA-4,保持未分化状态的转录因子OCT-4,胚胎多能性维持因子Nanog等;而且阳性表达成人干细胞(adult stem cell,ASC)表面标志物CD29和CD44等,在特定的诱导条件下能够分化为代表三胚层生殖层系。     

Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的对Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）进行分离培养,并检测其生物学特性。方法采用0．85％NH4Cl分离培养Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs,检测生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力鉴定。结果BMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力。第5代细胞生长速度较第3代略减慢。细胞周期显示93．79％细胞处于G0～G1期。表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达CD29和CD90,几乎不表达CD45。在体外能够向成骨细胞分化。结论Long-Evans大鼠股骨来源骨髓间充质干细胞经0．85％NH4Cl分离培养后,纯度高,具有良好生物学特性。