KGDS血栓靶向超声造影剂的制备及其初步评价

目的：探讨制备靶向结合活化血小板的脂质超声造影剂的新方法,评价制备的靶向超声造影剂体外与血栓靶向结合的能力。方法：首先合成荧光标记的,能与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合的赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽-棕榈酸化合物（KGDS-Palm）。采用“超声-高速剪切”法,以带荧光FITC的KGDS-Palm为主要原料之一,制备靶向脂质超声造影剂。马尔文公司粒径测定仪检测微泡大小及分布;Coulter计数仪分析浓度;荧光显微镜下观察KGDS多肽与微泡的结合情况;流式细胞仪评价多肽与微泡的结合效率;观察靶向微泡在体外的稳定性;采用体外血栓模型,检测靶向微泡与血栓靶向结合的特异性。结果：KGDS靶向超声造影剂呈淡黄色混悬液,微泡浓度约为1.5×109/mL,平均粒径为1.5 μm,98%的微泡小于5 μm。荧光显微镜显示靶向超声造影剂表面呈明亮的绿色荧光;流式细胞仪检测KGDS结合效率为90.04%;体外4 ℃保存48 h后微泡浓度及粒径无显著改变;体外靶向及其拮抗实验证实,靶向超声造影剂与血栓特异性结合。结论：采用“超声-高速剪切法”制备靶向超声造影剂,方法简单易行,有利于靶向造影剂的制备及纯化;KGDS靶向超声造影剂稳定性好、靶向结合特异性强。     

载CXCL12抗体靶向超声微泡制备及其体外卵巢癌细胞粘附性实验

目的 制备携带基质细胞衍生因子1(CXCL12)抗体的靶向超声微泡,检测其一般物理特性及体外寻靶能力.方法 通过生物素-亲和素桥接法将CXCL12抗体连接到声诺维微泡上,制备成靶向超声微泡,作为实验组,用流式细胞仪和荧光显微镜检测微泡的结合率及稳定性,体外粘附性实验观察靶向超声微泡与卵巢癌细胞的结合能力.以未连接CXC...     

Gαi2C-末端肽段靶向超声造影剂的制备及靶向性评价

目的 探讨制备携Gαi2 C-末端肽段(Gαi2ctp)靶向超声造影剂的可行性及靶向性.方法 根据Gαi2ctp的质量将靶向微泡分为0.5、1.5、3 mg/L三组,利用静电吸附法制备Gαi2ctp靶向微泡,通过检测微泡大小、携带率来探索其最佳结合剂量.选取最佳剂量进行动物实验,复制犬房颤模型,利用超声靶向微泡破坏技术...     

人前列腺癌靶向超声造影剂的制备及其体外实验研究

目的制备人前列腺细胞癌靶向超声造影剂,并对其进行鉴定,探讨其体外寻靶能力.方法静电吸附法制备免疫脂质体微泡造影剂;免疫荧光染色试验证明抗体与脂质体微泡的结合,普通光镜和荧光显微下观察微泡与前列腺癌细胞的结合情况,探讨靶向脂质体微泡对癌细胞的体外寻靶能力;同时以普通微泡作为对照.结果免疫脂质体微泡的荧光免疫染色试验为阳性;体外寻靶试验显示携带PSM(C-15)抗体的靶向脂质体微泡能较好地粘附于癌细胞周边;而对照组未见微泡与靶细胞的结合.结论采用静电吸附法成功制备了具有良好免疫活性的的人前列腺癌靶向脂质体造影剂,该造影剂在体外能高效特异性地与人前列腺癌细胞结合.     

靶向MAdCAM-1超声造影剂的制备及其体外寻靶实验研究

目的:制备适用于炎症性肠病超声诊断并靶向MAdCAM-1的长循环脂膜超声造影剂,并鉴定其物理性状及体外寻靶能力?方法:采用超声破碎法制备长循环脂膜超声微泡,通过“生物素-亲和素”法桥接超声微泡与抗MAdCAM-1单克隆抗体(MECA-367)?对制备出的靶向微泡造影剂进行物理性状检测;通过光镜和激光共聚焦显微镜观察该靶向造影剂对TNF-α诱导的炎症性肠病细胞模型的结合能力?同法制备携同型对照抗体IgG2a微泡作对照?结果:制备的靶向超声微泡形态好且粒径较均匀,平均粒径(464.5 ± 85.7)nm,Zeta电位(-19.3 ± 2.5)mV?SVEC4-10细胞MAdCAM-1的表达与TNF-α刺激时间成正相关?并且,当TNF-α浓度达到20 ng/ml时,MAdCAM-1的表达达到峰值?体外寻靶试验表明,该靶向造影剂较多并牢固地黏附到表达MAdCAM-1的细胞周围;携IgG2a的同型对照组未见明显结合?结论:成功制备出桥连MECA-367的靶向长循环脂膜超声造影剂,该造影剂在体外对高表达MAdCAM-1的炎性细胞模型有较强的特异性亲和力;TNF-α诱导SVEC4-10细胞建立炎症性肠病细胞模型的方法简便易行?     

血小板受体特异性微泡造影剂靶向粘附血栓的实验研究

目的构建能够靶向血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体的特异性脂质微泡，观察其对微血栓、体外人工血栓的粘附效应。方法用RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)耦联的方法构建靶向微泡，观察其对血小板聚集形成的微血栓的粘附效应。另在体外制作人工血栓模型，在二维超声下观察微泡造影剂对声学信号的影响。结果血小板聚集后加入经构建的靶向微泡，最后粘附在血小板微血栓周围；而加入普通微泡的对照孔则未见这种粘附效应。体外血栓模型中，未加微泡的血栓超声图像周围边界模糊，加入靶向微泡后血栓图像边界明显增强。结论血小板受体特异性靶向微泡对血栓有明显的趋附作用．并且能够增强血栓的超声信噪比。对血栓的临床诊断和治疗有潜在的意义。     

TATp和CXCR4修饰的载V P3基因超声微泡制备及体外寻靶实验

目的：制备一种载VP3基因、反式激活转录激活肽（TATp）与基质细胞衍生因子‐1（SDF‐1）同时修饰的新型载基因高分子靶向超声造影剂,表征其性质。方法采用W／O／W双乳化法制备载基因超声微泡。并通过硫醚键将SDF‐1与TATp共价连接到聚乳酸／羟基乙酸共聚物（PLGA）微泡的表面,制备成靶向载基因超声微泡。Malvern测量仪测定其粒径、分布及表面电位,流式细胞仪及共聚焦显微镜检测TATp、SDF‐1在高分子微泡表面的连接状况,酶切反应实验鉴定其对DNA的保护性,光镜观察及流式细胞仪初步评估其体外寻靶能力,超声考察体外成像。结果靶向载基因超声微泡呈规则球形。粒径为（536．00±16．55）nm ,分布集中,表面电位为（－0．08±0．08）mV。平均载药量为0．62％,平均包封率为36．13％。对DNA保护作用持续60 min ,未见损坏。TATp、SDF‐1同时加载于PLGA微泡表面的连接率为69．84％。体外寻靶实验显示,靶向微泡较多地稳定簇聚在舌癌SCC‐15细胞膜上,连接率为91．44％。而非靶向微泡较少结合,连接率为12．96％。体外超声显像呈细小点状、均匀高回声。结论成功制备出TATp‐SDF‐1‐VP3‐PEG‐PLGA微泡,其能在体外高效靶向结合舌鳞癌SCC‐15细胞,且短时间穿过细胞膜。体外成像效果较好。     

HER2靶向聚合物超声造影微泡的制备及其体外实验

目的：制备以HER2受体为靶点的靶向聚合物微泡超声造影剂,并观测其理化特性、体外肿瘤靶向性及体外超声显像效果。方法：利用生物素-亲和素法构建HER2靶向聚合物微泡,测定其粒径、电位,评价其稳定性。在体外肿瘤靶向性实验中观察其与HER2（+）的乳腺癌细胞BT-474以及HER2（-）的乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞结合情况。并观察靶向聚合物微泡体外超声显影效果。结果：HER2靶向聚合物微泡平均粒径为（1.78±0.37）μm,平均表面Zeta电位为（-37.40±5.74）mV。12 h内靶向聚合物微泡粒径变化差异无统计学意义（P＞0.05）。HER2靶向聚合物微泡在体外对HER2（+）肿瘤细胞具有特异靶向性。体外超声显像显示靶向聚合物超声造影剂呈细腻均匀的点状密集高回声。结论：HER2靶向聚合物微泡稳定性好,靶向能力较强,具有良好的体外超声显影效果,为进一步进行体内肿瘤靶向超声造影奠定了基础。     

血小板受体特异性微泡造影剂靶向粘附血栓的实验研究

目的 构建能够靶向血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的特异性脂质微泡,观察其对微血栓、体外人工血栓的粘附效应。方法 用RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)耦联的方法构建靶向微泡,观察其对血小板聚集形成的微血栓的粘附效应。另在体外制作人工血栓模型,在二维超声下观察微泡造影剂对声学信号的影响。结果 血小板聚集后加入经构建的靶向微泡,最后粘附在血小板微血栓周围;而加入普通微泡的对照孔则未见这种粘附效应。体外血栓模型中,未加微泡的血栓超声图像周围边界模糊,加入靶向微泡后血栓图像边界明显增强。结论 血小板受体特异性靶向微泡对血栓有明显的趋附作用,并且能够增强血栓的超声信噪比。对血栓的临床诊断和治疗有潜在的意义。     

载肝癌细胞GPC3抗体的纳米级脂质超声微泡制备及体外寻靶研究

目的：探索制备载肝癌细胞磷酯酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3,GPC3）抗体的新型纳米级脂质超声微泡造影剂的方法,并评价其体外对肝癌细胞的靶向结合效果。方法：以机械振荡法制备纳米级脂质微泡,并通过光学显微镜及电子显微镜检测纳米微泡大小形态、粒径分布;生物素-亲和素桥接肝癌细胞GPC3抗体与纳米级脂质超声微泡,流式细胞仪检测微泡与抗体结合效率;免疫组化检测常见3种肝癌细胞的GPC3阳性表达;微泡体外与肝癌细胞靶向结合,激光共聚焦显微镜检测寻靶效果。结果：纳米脂质微泡呈圆形,分布均匀,无明显聚集,粒径范围约350~450 nm。微泡与抗体结合效率达85.05%,人SMMC-7721、HepG2及Huh7肝癌细胞GPC3表达阳性,激光共聚焦显微镜显示载GPC3抗体纳米级脂质微泡可与肝癌细胞特异性结合。结论：本研究成功制备了具备靶向性的新型纳米级脂质超声微泡,生物素-亲和素桥接GPC3抗体可特异性结合肝癌细胞,达到靶向性识别效果,为微泡的靶向诊断及治疗研究奠定了基础。     

应用琼脂糖流动腔模型评价携αvβ3-整合素单抗超声微泡靶向血栓效能

目的体外评价携αvβ3-整合素单抗超声微泡(MBp)靶向血栓的黏附效能。方法将采用亲和素-生物素桥接法构建的MBp和同型对照微泡(MB)随机注入自制琼脂糖流动腔模型内,与人血栓孵育30min后,PBS液15cm/s流速不间断冲洗血栓,分别在冲洗血栓2﹑4﹑6﹑8﹑10min时行对比超声检查并测量声强度(VI)值。结果MBp孵育组血栓VI值较冲洗前减小了28%～66%,而对照MB孵育组血栓VI值减小了87%～94%。VI值在各时间点MBP组均较MB组大(P<0.05)。结论MBp具有较好的靶向结合血栓效能,靶向血栓黏附后能抵抗一定的剪切应力。体外模拟体内剪切应力血流环境评价MBp的靶向血栓黏附效能将有助于预测MBp应用于体内血栓超声分子成像的效果。     

C3F8脂质体超声微泡造影剂制备的初步研究

目的:制备稳定的脂质体C3F8气体微泡,为深入研究sulfatide导向的靶向声学造影剂准备必要材料.方法:通过改变卵磷脂、胆固醇和硬脂酸的比例及水化液成分,采用薄膜水化法,分多组实验,探索制备脂质体C3F8气体微泡的条件,观察和记录其物理特性参数.结果:质量比为3/1/(0.2-0.4)的卵磷脂/胆固醇/硬脂酸混合物的乙醚溶液,在压力-0.030MPa至-0.035MPa、转速130 r/min、37℃水浴加热的条件下旋蒸35 min左右制膜,然后用20％葡萄糖PBS进行水化,充入C3F8气体,50℃水浴70 min和超声30 s的条件下,所制备的微泡大小在2-4μm,平均半衰期为119 min,表面带有更多的负电荷(平均电势-7.12).结论:在该条件下制备的脂质体C3F8气体微泡造影剂的形态相对规则、粒径均一、稳定性好,符合通过肺循环的条件要求,下一步可以在此基础上进行导向分子的偶联研究.     

冻干法制备VEGFR2靶向超声微泡体外寻靶及显影实验

目的 采用冻干法制备血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）靶向超声造影剂,并评价其体外寻靶能力及超声显影效果。方法 冻干法制备生物素化微泡,将链霉亲和素及VEGFR2单克隆抗体依次连接至生物素化微泡,构建VEGFR2靶向超声微泡。采用免疫荧光染色法验证链霉亲和素及大鼠抗小鼠VEGFR2单克隆抗体与微泡的结合情况。观察及检测VEGFR2靶向超声微泡的形态、大小及分布。体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)至对数期,分3组,分别为非靶向超声微泡组（加入非靶向微泡1×107个）、抗体预饱和+VEGFR2靶向微泡组（加入过量的VEGFR2抗体孵育后,再加入VEGFR2靶向超声微泡1×107个）及VEGFR2靶向超声微泡组（加入VEGFR2靶向超声微泡1×107个）,比较各组微泡与细胞的结合情况。采用自制体外循环装置并采集超声图像,检测VEGFR2靶向超声微泡体外显影能力。结果 通过免疫荧光染色法的验证,链霉亲和素及大鼠抗小鼠VEGFR2单克隆抗体可与生物素化微泡结合构建VEGFR2靶向超声微泡。VEGFR2靶向微泡光学显微镜下呈圆形,大小一致且分布均匀,平均直径为（1.31±0.93） μm。显微镜下见非靶向微泡组HUVEC周围可见少量微泡结构,抗体预饱和+VEGFR2靶向超声微泡组HUVEC周围几乎无微泡结构,VEGFR2靶向超声微泡组HUVEC周围可见较多微泡结构存在。在超声增强模式下自制微泡显影效果良好,随造影时间延长无明显衰减。结论 冻干法可制备VEGFR2靶向超声造影剂,在体外实验中具有良好的寻靶能力且超声辐照下可显影。     

靶向超声分子成像与“炎症”的现状、面临挑战和对策

利用超声微泡表面固有的生物学特性或通过特殊处理将特定配体连接于超声微泡表面可构建成靶向超声微泡,靶向超声微泡经静脉注入后能靶向性聚集并较长时间滞留于靶组织或靶器官中,并通过对比超声产生分子水平成像。实验研究表明,靶向超声分子成像技术可无创性的定量评价靶组织或靶器官的"炎症",该领域近年来的研究进展十分迅速。     

超声分子靶向显像体外胰岛移植立即经血液介导的炎症反应

目的：探讨采用赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Lys-Gly-Asp-Ser,KGDS)血栓靶向超声造影剂显示体外 胰岛移植立即经血液介导的炎症反应(immediately blood-mediated inflammatory reaction,IBMIR)可行性,为无创、实 时、动态地研究和评价IBMIR探索一种新的分子影像学方法。方法：7 mL新鲜全血+1 000 胰岛当量(islet equivalent quantity,IEQ)新生猪胰岛体外制作IBMIR模型。实验分为3组,均重复3次：A组对照组,不加造影剂;B组加普通 超声造影剂;C组加靶向超声造影剂。将上述各组Loops管道固定于摇床,并浸于37 ℃的水浴中。采用超声造影模式 实时观察Loops管内的回声,记录超声发现血栓出现的时间;并采用Line成像模式存储在硬盘,脱机分析血栓超声增 强强度。实验开始后10,30,60 min 3个时间点,经70 μm过滤网过滤Loops管内血液,测定过滤液体的凝血系统[凝血 酶抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,ATA),D-二聚体(D-dimer)]、补体系统(C3a,C5b-9)及胰岛素含量 等指标,过滤网内血块做病理学检测。结果：A组没有加入造影剂,超声不能发现血栓形成;B组、C组加入超声造 影剂后超声可以发现血栓,其中B组加入自制普通超声造影剂,血栓在超声图像上显示为周边及内部无增强,呈充盈 缺损改变,发现血栓时间为(7.3±0.5) min,相应血栓超声增强强度的灰阶值为31.22±3.56;C组加入靶向超声造影剂, 超声清晰显示环状增强的血栓,发现血栓时间为(13.2±0.6) min,其超声增强强度的灰阶值为75.85±5.21。B组、C组血 栓灰阶值及发现时间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。血液学检测证实各实验组均发生了IBMIR;病理结果显示胰 岛与新鲜全血接触后,其表面形成血栓壳,加入带荧光的靶向超声造影剂,荧光显微镜可以清楚观察到胰岛周边呈 明亮的荧光光环,与血栓壳位置、形态、范围完全吻合。结论：超声分子影像技术可以靶向显像体外IBMIR,为无创 评估IBMIR的发生及其范围、程度提供了可能。