人喉癌细胞端粒酶催化亚基cDNA片段的扩增与克隆

目的：测定人喉鳞状上皮癌hep-2细胞的端粒酶活性水平并获得hep-2细胞中hTERTcDNA片段的克隆，方法：采用TRAP-ELISAS法测定酶活性水平，RT-PCR技术扩增获得目的片段，利用酶切法、PCR法和序列分析法对所获克隆进行检测。结果：hep-2细胞具有较高的端粒酶活性水平，获得含hTERTcDNA片段的克隆。结论：利用RT-PCR法能够从具有较高端业酶活性水平的hep-2细胞中扩增获得hTERTcDNA片段。     

端粒酶逆转录酶基因启动子的克隆及其转录活性的检测

端粒酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶,催化合成端粒的DNA重复序列,并引导端粒添加到染色体的尾端,对维持染色体的长度、调节细胞增殖和凋亡起重要作用[1]。正常人的体细胞中通常检测不到端粒酶的活性,而约90％的肿瘤细胞的端粒酶活性却大大增强[2]。因此,端粒酶是肿瘤治疗的一个很有吸引力的靶子。端粒酶的核心结构包括RNA和具有逆转录酶活性的催化蛋白(telomerase reverse transcrip-tase,TERT)。业已证明,TERT是决定端粒酶活性的主要因素[3,4]。本研究通过PCR的方法克隆了TERT基因的启动子,并鉴定其在各种肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性。     

卵巢恶性肿瘤细胞端粒酶表达和hTERT基因，c—myc基因的调控

目的　研究端粒 (TL M)在卵巢恶性肿瘤中的表达和相互关系。　方法　 (1)采用 PCR- EL ISA半定量方法研究端粒酶活性在卵巢恶性肿瘤、癌旁组织、交界性肿瘤、良性肿瘤、正常卵巢及卵巢肿瘤细胞株的表达情况。(2 )采用 RT- PCR方法检测人端粒酶逆转录酶 (h TERT)基因 m RNA和 c- myc基因m RNA在上述标本中的表达情况 ,分析端粒酶活性、h TERT基因、c- myc基因间的关系。(3)用顺铂对卵巢肿瘤细胞株 HO-8910、COC1 进行处理 ,同步检测 h TERT和 c- myc基因 m R-NA、端粒酶活性表达情况 ,分析 h TERT和 c- myc基因 m R-NA水平改变与端粒酶活性的相互影响。　结果　 (1)卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢端粒酶活性差别无显著性 (P>0 .0 5 ) ,正常卵巢端粒酶活性 0 .2 2为上限 (0 .2 13± 0 .0 70 ,可信区间97.5 % ) ,恶性卵巢肿瘤组织端粒酶活性表达率 91.30 % ,明显高于交界性卵巢肿瘤组织 2 0 .0 0 % (P<0 .0 1)、良性卵巢肿瘤组织 7.13% (P<0 .0 1)和正常卵巢 0 (P<0 .0 1)。交界性卵巢肿瘤组织端粒酶活性表达率与后两者差异具有显著性 (P<0 .0 1)。端粒酶活性值在恶性卵巢肿瘤组织表达中临床分期 、 期明显高于 、 期 (P<0 .0 5 ) ,分化程度低者高于分化高者 (P<0 .0 5 ) ,恶性卵巢肿瘤组织端粒酶活性明显高     

hTERT基因反义核酸对8910卵巢癌细胞端粒酶活性的影响

目的　研究人类端粒酶催化亚单位 (h TERT)基因的反义寡核苷酸对卵巢癌细胞的影响 .方法　采用 TRAP-EL ISA检测 8910卵巢癌细胞在反义核酸处理前后端粒酶活性的变化 .结果　 h TERT基义反义核酸能有效抑制 8910细胞端粒酶活性 .结论　 h TERT基因反义核酸能显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性 ,为恶性肿瘤治疗提供了一条新的有效的途径     

人端粒酶反转录酶与肿瘤的研究进展

端粒是真核细胞维持自身染色体稳定的重要成分,其DNA序列位于染色体的末端,端粒的长度会随着染色体的不完全复制和细胞分裂而逐渐缩短。端粒酶相关基因的突变会造成端粒酶活性的降低以及端粒长度缩短,过短的端粒无法保护基因组维持正常的稳定性,最终造成细胞的老化、凋亡或恶变。人端粒酶反转录酶(h TERT)基因的表达水平与端粒酶的活性一致,其表达被认为是端粒酶活性的关键步骤。该文就h TERT与肿瘤的关系予以综述。     

基质金属蛋白酶-2C端片段pex的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 :克隆小鼠基质金属蛋白酶 - 2 ( MMP- 2 ) C端片断 pex编码区的 c DNA序列 ,并构建其真核表达载体 ,为进一步研究其抑制肿瘤作用奠定基础。方法 :根据基因 Gen Bank中 MMP- 2基因的碱基序列 ,利用 RT- PCR的方法从 NIH3T3细胞中分别扩增信号肽及目的基因 pex,然后用多重 PCR的方法将两个片段拼接起来 ,再将拼接起来的目的片段 sig- pex与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,利用亚克隆的方法将 sig- pex c DNA片段克隆到 pc DNA3.1载体中。结果 :DNA测序证实该片断序列与文献报道完全一致。结论 :成功构建出 pc DNA3.1 - sig- pex真核表达载体     

RNA干扰对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖的影响

目的 探讨针对人端粒酶RNA(hTR) 及其催化亚基(hTERT) 的小干扰RNA (siRNA) 对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响. 方法 根据人TR mRNA和TERT mRNA的序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA(TR-siRNA, TERT-siRNA),通过脂质体法将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量PCR分析TR、TERT mRNA 表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,MTT 法检测细胞增殖. 结果 3对TERT-siRNA和3对TR-siRNA中,pRNAT-TERT-Ⅲ和pRNAT-TR-Ⅲ可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达(分别减少67%和41%,P<0.05),且BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性明显受到抑制. 结论 TR-siRNA和TERT-siRNA能特异且高效阻断各自基因表达,降低端粒酶活性,进而抑制BIU-87细胞的增殖.     

大肠癌端粒酶活性的意义及其与人端粒酶催化亚基表达的相关性

目的 :研究大肠癌组织中端粒酶活性在大肠癌发生发展中的作用及其与人端粒酶催化亚基 (h TERT)表达的相关性。方法 :运用 PCR- TRAP- EL ISA及免疫组织化学方法 (免疫组化法 )对 30例大肠癌及相应的癌旁组织、正常大肠组织及 2 0例大肠腺瘤性息肉组织中端粒酶活性和 h TERT表达进行检测。结果 :1端粒酶在大肠癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织、正常大肠黏膜及大肠腺瘤性息肉 (P<0 .0 5 ) ;2大肠癌组织端粒酶与淋巴结转移关系密切 ,伴淋巴结转移大肠癌端粒酶阳性表达率明显高于无淋巴结转移者 (P <0 .0 1 ) ;3相关分析显示端粒酶活性与 h TERT表达存在相关性 (P <0 .0 5 )。结论 :端粒酶在大肠癌的发生发展过程中可能起着重要作用 ,h TERT的表达与端粒酶活性密切相关     

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。     

L-精氨酸对HeLa细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨L-精氨酸对HeLa细胞端粒酶活性的影响。方法:采用端粒酶重复序列扩增法-银染法检测端粒酶活性的变化。结果:L-精氨酸浓度低于1mmol/L组,端粒酶活性没有明显改变;5～25mmol/L组,端粒酶活性显著增强;50~100mmol/L组,端粒酶活性显著受到抑制。不同浓度L-精氨酸室温处理HeLa细胞提取液2h后,端粒酶活性与对照组无显著差异。结论:体内L-精氨酸浓度的变化引起端粒酶活性的改变,提示L-精氨酸引起的肿瘤发生发展与端粒酶活性改变有关。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

hTERT基因荧光真核表达载体的构建及表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义荧光真核表达载体，并检测其在人胚胎成纤维细胞中的表达．方法：采用基因重组技术，将hTERT cDNA正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-EGFP中，NotI酶切鉴定；采用脂质法，将重组基因pIRES2-EGFP-hTERT转染入原代培养的人胚胎成纤维细胞；采用激光共聚焦显微镜、RT-PCR及Western blot检测hTERT在胚胎成纤维细胞中的表达．结果：经NotI酶切后，hTERT正义重组质粒被切成1．4kb和7．4kb2个片段，反义重组质粒为4．8kb和4．0kb2个片段，与理论预期长度相符；pIRER2-EGFP-hTERT重组基因经脂质法转染，G418筛选，获得一个阳性克隆，激光共聚焦显微镜下可见明显的绿色荧光，RT-PCR及Western blot可见hTERT mRNA转录及其蛋白的表达。结论：成功构建了h TERT正义荧光真核表达载体，并可在人胚胎成纤维细胞中表达。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子，并观察hTERT启动子调控下tk／GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物，以HepG2基因组DNA为模板，用PCR方法扩增hTERT启动子；分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体：将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后。通过RT—PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况；用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp～ 40bp的核心启动子。RT-PCR和B-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达．hTERT启动子调控的tk／GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞，表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

端粒酶在面突外胚间充质细胞干细胞中的表达

目的: 探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况. 方法: 体外培养妊娠50 d人胚胎面突外胚间充质干细胞,白血病抑制因子(LIF)抑制细胞分化,于第1, 8, 15和第22代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析,同时检测无LIF抑制下,第5代细胞自发分化10 d端粒酶逆转录酶的表达情况. 结果: 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降. 在分化状态,该细胞不再表达端粒酶逆转录酶. 结论: 早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老.     

hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路.方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况.结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平.结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础.而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标.     

RNAi靶向人端粒酶逆转录酶对人肝癌细胞的生长抑制作用

目的 利用RNAi技术降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,研究其对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响.方法 构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仅检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况.结果 成功制备出hTERT siRNA逆转录病毒表达载体;重组病毒感染HepG2细胞24、48、72 h后端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%(P＜0.05);感染后24 h细胞凋亡率29.05%;MTT实验结果显示肿瘤生长受到抑制,并存在一定量效和时效关系.结论 hTERT siRNA能特异性使hTERT基因表达抑制,端粒酶活性下降,肝癌细胞增殖受到抑制.     

人类TAP1基因克隆及表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1的构建

目的 克隆TAP1(抗原处理相关转运1)基因cDNA序列,构建其真核表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA-TAP1。方法 从人类B-LCL细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增TAP1基因片段,将该段基因克隆到表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA上测序。结果 通过RT-PCR扩增获得1个2593bp的DNA片段,测序分析表明为TAPl基因。结论 通过RT-PCR等技术成功克隆出人类TAP1基因并成功构建了表达载体peDNA3．1／VS-His TOPO TA-TAP1。