Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

间充质干细胞可向神经方向转化,但分子机制目前不清楚。 目的：观察Wnt3a和Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用。 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后通过形态学和流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14,CD44,CD9,CD34,CD45表达。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a的诱导方案,免疫组织化学法和RT-PCR检测Wnt3a、Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中的作用。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,表面标志物CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。诱导后细胞Wnt3a诱导组巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,细胞活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确。 目的：寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

Wnt3a调控大鼠骨髓间充质干细胞向胆碱能神经元分化的实验研究

目的 探讨经典Wnt/β-catenin通路对大鼠MSCs在体外分化为神经元和胆碱能神经元的调节作用。方法 取SD大鼠股骨和胫骨的骨髓,利用差速贴壁法分离、扩增及纯化MSCs,绘制生长曲线; 应用免疫荧光和Western-Blot的方法检测Wnt3a处理后β-catenin蛋白的分布变化; 取第4代MSCs分为3组; A组为空白对照组,用空白DMEM培养基培养细胞; B组为诱导分化对照组,用含100 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grown factor, bFGF)、5 umol/L维甲酸(retinoic acid, RA)的DMEM诱导培养基培养细胞; C组为Wnt3a诱导分化组,在上述诱导培养基中加入50 ng/mL Wnt3a培养细胞; 用形态学观察和Western-Blot的方法比较各组对MSCs向神经元及胆碱能神经元分化的影响; 应用形态学观察和Western-Blot的方法比较各组对MSCs向神经元及胆碱能神经元分化的影响。结果 利用差速贴壁法细胞传至P3代时形态趋于一致,呈均匀分布生长。P3代细胞的生长曲线显示,接种后的第1、2 d细胞处于潜伏期; 第3、4 d细胞进入对数生长期; 第5 d进入平台期。P4代细胞高度表达CD29和CD44(阳性率分别为99.9%和73.2%)。Wnt3a处理组细胞的β-catenin在细胞核的分布较对照组细胞显著增多(P<0.01)。诱导分化细胞组中A组细胞可检测到少量神经元的标记物,但未检测到胆碱能神经元的标志物,B组和C组细胞均可检测到神经元和胆碱能神经元的标志物,B组和C组分化为神经元的比例较A组显著增高(P<0.01); C组分化为胆碱能神经元的比例较B组显著增高(P<0.01)。结论 Wnt3a能够促进MSCs内的β-catenin的核转移激活经典Wnt信号通路,促进体外培养的MSCs向胆碱能神经元分化。     

多种诱导剂联合对大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的影响

目的 探讨多种诱导剂联合对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外向神经元样细胞分化的影响.方法 从Wistar大鼠骨髓中分离rMSCs并进行体外培养,经免疫荧光染色及流式细胞仪行CD44、CD45和CD90鉴定后,将传第3代的rMSCs用DMEM、0.1 mmol/L β-巯基乙醇(BME)和2％二甲基亚砜(DMSO)预诱导5h后,给予10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10 μg/L表皮生长因子(EGF)、10 μg/L肌酸联合诱导7d.应用荧光相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光染色和流式细胞仪对神经元标志物进行鉴定.结果 诱导后约80％ rMSCs呈神经元样改变,神经元标志物阳性率分别是巢蛋白为(42.14±2.85)％、神经细丝蛋白为(17.13±1.03)％、β-微管蛋白-Ⅲ为(20.42±1.98)％、胶质纤维酸性蛋白为(39.97±2.34)％、微管结合蛋白-2为(39.30±1.72)％、胆碱乙酰转移酶为(21.30±1.83)％.结论 多种诱导剂(BME、DMSO、bFGF、EGF和肌酸)联合可诱导约80％ rMSCs向神经元样细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元分化

目的　探讨大鼠中胚层来源的骨髓间充质干细胞(MSCs),在诱导因子的诱导下体外向神经元方向分化的能力。方法　贴壁法分离的MSCs,用NIM诱导,相差显微镜观察细胞形态变化,神经元特异抗体NeuN,MAP2,NSE免疫组化染色鉴定转化情况。结果　在诱导后30～40min即开始形态变化,形成神经元样的细胞,免疫组化染色神经元样细胞表达NeuN(50.83%±3.43%),NSE(59.83%±9.24%)和MAP2(45.17%±8.42%)。结论　MSCs在体外诱导下可以分化为神经元样的细胞,表明它是有别于一般成体干细胞的多能干细胞。     

成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱

目的 寻求一种将成人骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的最佳诱导剂及诱导时间 方法：用不同诱导剂将成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化,分为四组：组一：GDNF(20μg/L) +RA(0.3 mg/L)组二：BDNF(20μg/L)+RA(0.3 mg/L) 组三：GDNF(20μg/L)+BDNF(20μg/L)+RA(0.3 mg/L)组四：空白对照 各组均加入2.5％胎牛血清,分别于诱导后12小时,24小时,48小时,96小时后于倒置显微镜下观察各组细胞形状,并进行细胞计数,胎盼兰检测细胞活力,并 行免疫组化鉴定。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、全反式维甲酸（RA）、神经营养因子（BDNF）在体外诱导BM—SCs向神经元样细胞分化的作用。方法采用出生3周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为三组：A组,bFGF＋EGF＋RA进行诱导分化;B组,BDNF＋RA进行诱导分化;C组,RA诱导分化。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫细胞化学技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗鉴定。结果A组诱导5d后有大部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达。而B组可有部分NSE阳性细胞、C组细胞有少量NSE阳性细胞。结论bFGF＋EGF＋RA、BDNF＋RA和RA均可在诱导BMSCs向神经样元细胞分化,bFGF＋EGF＋RA组更优于和BDNF＋RA组及RA组。     

人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的体外研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSC)向神经元和多巴胺神经元分化的潜能。方法分离和纯化hMSCs;在体外以WHI-P131预处理和碱性成纤维细胞生长因子预诱导后,全反式维甲酸和胶质细胞源性神经营养因子联合诱导hMSCs向神经元和多巴胺神经元分化。光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化,免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经元和多巴胺能神经元标志蛋白。结果诱导后的hMSCs能分化成为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达抗人神经巢蛋白(nestin)[(54.2±3.7)%]和神经元特异性烯醇化酶(NSE)[(77.0±5.7)%],低表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)[(8.8±2.4)%];对照组细胞这些表达均为阴性;而且相当部分hMSCs表达酪氨酸羟化酶(TH)[(36.5±15.8)%]和多巴胺转运体(DAT)[(26.0±14.2)%]。结论在适当条件下,hMSCs可分化成为神经元样细胞和多巴胺神经元样细胞。     

人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化

骨髓间充质干细胞具备取材方便、对组织损伤小等优点,其低免疫原性及易于诱导机体的免疫耐受性,使得在不需要HLA配型的前提下也可以进行异体移植,从而减少免疫抑制剂的副作用。目前常采用密度梯度离心法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,可根据生物学特性、细胞表面标记、多分化潜能、低免疫原性和免疫调节功能对其进行鉴定。骨髓间充质干细胞虽来源于中胚层,但在相应的诱导下可以向内胚层或外胚层的方向分化,一般选取传至第5代的骨髓间充质干细胞,除在培养液中加入传统的诱导剂如神经生长因子、维甲酸、脑源性生长因子、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子外,向培养液中加入二十二碳六烯酸和花生四烯酸可诱导加速骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,并促进神经元轴突的生长。但是骨髓间充质干细胞移植的安全性,尤其是致瘤性的问题仍有待进一步研究。     

成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(adult rat marrow mesenchymal stem cells,rMSCs)的体外增殖和特异性诱导分化为神经元样细胞的能力.方法 分别采用3种不同的诱导方法体外定向诱导第三至五代的rMSCs向神经元样细胞分化,并分别应用相差显微镜观察神经元样细胞和免疫细胞组化检测神经元样细胞所表达的神经元特异性标志[神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和神经丝蛋白(neurofilament,NF)]及星形胶质细胞特异性标志[胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP)],并进行神经元样细胞定量分析.结果 所采用的3种定向诱导方法都能使rMSCs特异性诱导分化为神经元样细胞,此神经元样细胞都能特异性地表达出NSE和NF,而不表达GFAP.经过定量计数分析发现用上述方法处理rMSCs 后出现NSE阳性的细胞约为75.5%±3.5%,出现NF阳性的细胞约为77.2%±2.8%.结论 rMSCs能在体外扩增、传代,并能被定向诱导分化为神经元样细胞.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经类细胞分化

BACKGROUND： Chemical induction has been shown to be effective at promoting the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs）. However, these inductors have cytotoxicity side effects that may damage cells over time. Traditional Chinese medicines avoid this disadvantage while still producing effective induction.
OBJECTIVE： To investigate the influence of RadixAstragafi （Huangql） on the differentiation of MSCs.
DESIGN, TIME AND SETTING： In vitro study of traditional Chinese medicine in neural stem cell differentiation. The experiment was performed at the Central Laboratory of Hebei North University between April and June 2007.
MATERIALS： Radix Astragafi solution （lot No. 060105; license No. Z53021585） was purchased from Dali Pharmaceutical Co., Ltd., China; rabbit anti-rat nestin, rabbit anti-rat neuron-specific enolase （NSE）, mouse anti-rat microtubule-associated protein 2, and rabbit anti-rat glial fibrillary acidic protein were purchased from Wuhan Boster, China.
METHODS： Whole bone marrow was isolated from the femur and tibia of 6-week-old male Wistar rats and subcultured. The fourth passage of MSCs were harvested and induced by different concentrations （50, 100, 200, 400 g/L） of Radix Astragali.
MAIN OUTCOME MEASURES： Hematoxylin-eosin staining was used to observe MSC morphology after 24 hours of induction. Immunocytochemistry was employed to observe the expression of NSE （specific neuronal marker）, nestin （marker of neural stem cell）, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 （markers of astrocytes）.
RESULTS： Following Radix Astragali treatment, changes occurred in cell morphology including： cell body pyknosis; thin and long processes formed in some cells, with growth corresponding to drug concentration and induction time; and the formation of network-like connections between some cells. With increasing drug concentration and induction time, nestin expression was upregulated, and the number of positive cells increased; cells produced NSE, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2; nestin was expressed earlier than glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 expression. In addition, the number of NSE-positive cells was increased significantly more than glial fibrillary acidic protein-positive cells.
CONCLUSION： Radix Astragafi promoted process formation in stem cells. It may induce the differentiation of MSCs into neural stem cells, and subsequently into neuronal- and glial-like cells. Radix Astragafi exhibits stronger inductive effect on neuronal differentiation than glial differentiation of MSCs.     

成年大鼠骨髓间质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间质于细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性。方法 通过全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。应用流式细胞仪测定细胞周期,并研究其增殖及生长特征。结果 原代及传代培养显示,10代以前的MSCs具有活跃的增殖能力,细胞周期分析显示有168％的MS＆处于S＋G2／M期。MS＆细胞形态可呈梭形、圆形或椭圆形,经传代融合时呈漩涡状、菊花状排列。结论 体外培养10代以前的MSCs生长稳定,增殖较快,为进一步开展中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。 目的：比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异。 方法：采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代。分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d。 结果与结论：胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小。两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106。二者均可分化为脂肪细胞。可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景。     

Generation of neural stem cell-like cells from bone marrow-derived human mesenchymal stem cells

Under appropriate culture conditions, bone marrow (BM)-derived mesenchymal stem cells are capable of differentiating into diverse cell types unrelated to their phenotypical embryonic origin, including neural cells. Here, we report the successful generation of neural stem cell (NSC)-like cells from BM-derived human mesenchymal stem cells (hMSCs). Initially, hMSCs were cultivated in a conditioned medium of human neural stem cells. In this culture system, hMSCs were induced to become NSC-like cells, which proliferate in neurosphere-like structures and express early NSC markers. Like central nervous system-derived NSCs, these BM-derived NSC-like cells were able to differentiate into cells expressing neural markers for neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Whole-cell patch clamp recording revealed that neuron-like cells, differentiated from NSC-like cells, exhibited electrophysiological properties of neurons, including action potentials. Transplantation of NSC-like cells into mouse brain confirmed that these NSC-like cells retained their capability to differentiate into neuronal and glial cells in vivo. Our data show that multipotent NSC-like cells can be efficiently produced from BM-derived hMSCs in culture and that these cells may serve as a useful alternative to human neural stem cells for potential clinical applications such as autologous neuroreplacement therapies.     

骨髓和脂肪来源间充质干细胞的免疫调节作用☆

背景：脂肪来源的间充质干细胞是否具有和骨髓来源间充质干细胞类似的免疫调节作用?目的：观察骨髓来源和脂肪来源间充质干细胞的免疫学特征。方法：分离骨髓和脂肪来源的间充质干细胞,分别检测它们对T细胞周期、活化、抑制和增殖的作用情况。结果与结论：骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞同样具有抑制T细胞增殖的能力,在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T细胞增殖中这种作用都是具有剂量依赖性的,在1︰2时有极强的抑制作用,但是在1︰100时这种作用基本消失,在共培养时骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞都可以使更多的T细胞被抑制在G0/G1期,同时也可以抑制T细胞的早期活化,但是上述作用脂肪来源的间充质干细胞均较骨髓来源间充质干细胞弱,且脂肪来源的间充质干细胞并不具有抑制T细胞凋亡的作用。     

大鼠骨髓来源肝干细胞的成瘤性*

背景：通过动员自身或移植外来的骨髓来源肝干细胞可促进肝再生,但是,在大规模临床应用前,其安全性需要进一步研究。目的：采用含体积分数5%淤胆血清的培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化,将这些骨髓来源肝干细胞接种到裸鼠体内,观察其是否具有成瘤性。方法：用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞;以免疫荧光法检测白蛋白、甲胎蛋白及细胞角皮素18在诱导后细胞的表达;以糖原染色及尿素合成检测细胞功能。 将培养14 d的大鼠骨髓来源肝干细胞接种于裸鼠皮下,观察局部有无新生物形成。结果与结论：用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞,4 d后出现细胞集落,细胞为圆形;7 d后集落变大,其周围开始出现多角形细胞;培养14 d后可见细胞呈多角形和排列成铺路石样,免疫荧光染色发现这些细胞表达角皮素18、甲胎蛋白和白蛋白,糖原染色显示细胞内有糖原颗粒;培养第12~15天的培养液中尿素氮浓度逐渐升高。经诱导的大鼠骨髓来源的肝干细胞接种到裸鼠皮下,30 d后局部未见新生物形成,组织结构未见异常。结果提示用体积分数5%淤胆血清培养基诱导的大鼠骨髓源性肝干细胞可能无成瘤性。     

骨髓间充质干细胞在周围神经系统的应用

1968年。Friedenstein发现骨髓中存在一类可以单克隆形式增殖．在体外培养过程中细胞形态与集落方式类似成纤维细胞的细胞，这类细胞与造血干细胞完全不同。实验发现在体外培养这类细胞的过程中，严格控制其所处的微环境，这类细胞可向骨、软骨、脂肪．肌肉、神经元及神经胶质细胞等间充质来源的细胞类型分化，在体内移植后同样具有这一特性，因而将其命名为骨髓间充质干细胞。[第一段]     

乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡机制

BACKGROUND: Previous studies demonstrated that ethanol can induce apoptosis in bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), and decrease the number of osteoplasts and osteoclasts. However, the effect and mechanism of ethanol on apoptosis in BMSCs remains unclear. OBJECTIVE: To investigate the effect of ethanol on apoptosis in BMSCs of rats and their mitochondrial function and to evaluate the pathway associated with the regulation of Bcl-2 and Caspase-3. METHODS: BMSCs were isolated from Sprague-Dawley rats were treated with ethanol at doses of 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mmol/L for 24 hours. cytotoxic drug experiment was performed with MTT assay. BMSCs were treated with ethanol at doses of 0, 100, 200, 300, 400, 500 mmol/L for 6, 12, 24 hours, AnnexinV/PI flow cytometry of double label method was performed to detect the apoptosis and mitochondrial membrane potential, BMSCs were treated with ethanol at doses of 0, 427 mmol/L for 24 hours, the levels of Bcl-2 and Caspase-3 mRNA expression were determined by RT-PCR method. RESULTS AND CONCLUSION: MTT assay results showed that 50% concentration of inhibition (IC50) of BMSCs of rats grew in ethanol was 427 mmol/L. The results of Annexin V/PI assay indicated that the apoptosis rates of BMSCs and mitochondrial membrane potential were higher than that of untreated (0 mmol/L) group when time and dose of ethanol was increased (P < 0.05). Compared with 0 mmol/L group, the level of Bcl-2mRNA expression was decreased in 427 mmol/L group after 24 hours, but the caspase-3 mRNA expression was increased significantly by treatment at 427 mmol/L (P < 0.05). These results suggest that ethanol can induce apoptosis in BMSCs of SD rat, and the occurrence of apoptosis may be related to the mitochondrial membrane potential damage, mitochondrial dysfunction, bcl-2 and Caspase-3 activation.