真核细胞阳性细胞克隆的筛选与鉴定

大多数真核蛋白在真核细胞中翻译后,需经过加工、修饰才具有生物学活性,是真核蛋白在原核细胞中表达后没有生物学活性的主要原因之一.     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

人CD38分子基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆并表达人CD38抗原分子的全长cDNA。方法：采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中克隆出CD38全长cDNA并将其插入pGEM-T载体中，重新设计引物，引入酶切 位点，二次PCR；从重组pGEMT载体上扩增CD38抗原分子的cDNA编码序列，再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，用脂质体法转染COS7细胞。用免疫荧光及A－PAAP方法检测CD38抗原的表达。结果：克隆的CD38抗原的全长cDNA，经酶切鉴定及序列分析表明，其序列与文献报道完全一致。免疫荧光及APAAP方法检测表明，CD38抗原分子在COS7细胞中获得表达。结论：成功构建了CD38真核表达载体，并在COS7细胞中获得表达，对研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的：探讨用人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）早期基因Ｅ６羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）研制ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：采用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＰＶ１６中获得Ｅ６Ｃ端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染ＬＡ７９５小鼠肺腺癌细胞并检测Ｅ６Ｃ的表达。结果：成功构建了真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ,免疫组化结果显示真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ在ＬＡ７９５细胞中获得有效表达。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果成功构建了真核表达质粒pLNCE6C,免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试,为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。     

HBsAg在T7双质粒系统转染真核细胞中的表达

目的：研究双质粒T7表达系统在真核细胞中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的情况。方法：脂质体介导的T7双质粒共转染真核细胞，以斑点酶免疫试验(DOT-EIA)检测HBsAg表达情况。结果：HBsAg在质粒转染细胞后24h开始表达，72h达高峰。结论：T7双质粒表达系统能在体外培养的真核细胞中高效表达HBsAg，该系统可能在乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫、外源性蛋白的制备等方面发挥重要作用。     

凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

HBV全基因真核细胞表达载体的构建及表达

目的：构建全基因HBV真核细胞表达载体,并对其在细胞内的复制、转录、翻译进行研究。方法：采用分子亚克隆技术,将长约3.2Kb的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pBK-CMV折EcoPI位点,构建的pKB-HBV经FUGENE^TM6导入人肝癌细胞系SMMC－7721细胞中。结果：经PCR、RT－PCR验证pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制和转录。固相放免法显示HBV转染细胞内的HBsAg、HBeAg的合成和分泌。免疫组化法证明,胸内浆型分布为主的HBcAg的表达。结论：HBV全基因真核细胞表达载体pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制、转录及表达。     

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 采用常规PCR法扩增S、前S2－S、前S1－前S2－S片断,利用重叠PCR法扩增出前S1－S片断后,分别插入Rc/CMV及pSG5UTPL/Flag载体质粒中,并在其ATG起始密码前加入KOZAK序列后转染SP2／0细胞,Western-Blot杂交检测所表达蛋白,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果 插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的编码基因一致,Western-Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论 获得了8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的真核细胞表达质粒。     

重组人白细胞介素12基因在COS－7细胞的高效表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的高效真核细胞表达载体，通过ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ改良方法，共转染至ＣＯＳ－７细胞中。结果高效表达了ｒｈＩＬ－１２蛋白，表达量为６００Ｕ／ｍｌ；并研究其对人ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性的作用，为进一步研究ＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3-FHIT的构建及其在COS-1细胞中瞬时表达

目的 :构建FHIT基因的真核表达载体及测定其在COS 1细胞中的瞬时表达。方法 :应用RT PCR方法从正常人甲状腺组织中克隆出FHIT基因 ,在KpnⅠ和 BstXⅠ两个酶切位点插入真核表达载体 pcDNA3中 ,通过酶切分析、基因测序和免疫细胞化学方法鉴定插入基因片段的正确性。结果 :FHIT基因在载体 pcDNA3中插入的位点是正确的 ,没有缺失、插入等突变 ,并在COS 1细胞中有较高的瞬时表达。结论 :成功构建了FHIT基因的真核表达载体 ,并获得其在COS 1细胞中较高的瞬时表达 ,为该基因在基因治疗中的研究提供了有力的分子工具     

人Wnt10b基因真核表达载体的构建及表达鉴定

目的：利用基因工程技术构建人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10b真核表达载体,观察其在COS-7细胞中的表达。方法：以pUC19-Wnt10b为模板,PCR扩增人Wnt10b基因的cDNA编码区序列,扩增产物和pEGFP-N1载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pEGFP-N1-Wnt10b,酶切和测序鉴定该载体;LipofectamineTM2000将该载体转染入COS-7中,Western blot和免疫细胞化学检测COS-7 Wnt10b蛋白表达。结果：PCR扩增出的人Wnt10b基因cDNA正确克隆到pEGFP-N1载体,成功构建了pEGFP-N1-Wnt10b;将其转染入COS-7,COS-7 Wnt10b蛋白表达明显增高。结论：成功构建了人pEGFP-N1-Wnt10b,这为进一步研究Wnt10b基因功能奠定了前期基础。     

构建人类neuritin真核表达系统

目的：构建人类neuritin基因真核表达载体，并观察其转染的PC12细胞中neuritin的表达。方法：用基因重组技术，将人类Neuritin cDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDN A4．0中，经酶切鉴定及测序分析、并以脂质体介导转染PC12细胞，了解其在细胞内的表达。结果：酶切鉴定及测序分析，表明重组pcDNA4．0-neuritin表达质粒克隆成功．neuritin基因在PC12细胞中获得表达。结论：以脂质体介导pcDNA4．0-neuritin质粒转染真核细胞，为基因治疗神经系统退行性病变奠定实验基础。     

siRNA介导垂体瘤转化基因沉默抑制人泌乳素型垂体瘤凋亡的研究

目的探讨垂体瘤转化基因(PTTG)对人泌乳素型垂体瘤(HPA)细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对PTTG的特异性siRNA序列,通过siPORTTM NeoFXTM转入原代培养HPA细胞,Western blot法检测siRNA作用后PTTG蛋白表达,DNA ladder和annexin V/PI染色法检测PTTG沉默对细胞凋亡的影响。结果siRNA转染组细胞内PTTG蛋白表达减弱;在CDDP诱导后,对照组和siRNA组均出现细胞凋亡,siRNA组DNA ladder形成不明显,Annexin V染色凋亡细胞数目减少,对照组细胞凋亡率为18.6%,而siRNA组仅为8.7%。结论垂体瘤转化基因对人泌乳素型垂体瘤细胞具有促进凋亡作用。     

原癌基因pokemon的mRNA在肾癌中的表达及其意义

目的检测肾癌组织中pokemon的mRNA的表达,分析其与各临床病理特征间的关系。方法收集47例肾细胞癌手术切除的癌、癌旁及临近正常组织,应用逆转录实时聚合酶链反应（Real—timePCR）检测标本中pokemon基因的表达,并对其与肾癌的临床病理特征进行分析。结果Real—timePCR检测肾细胞癌、癌旁及正常对照组织中pokemon的mRNA表达有差异,具有统计学意义（P〈0．01）。肾细胞癌组织中pokemon的mRNA表达与肿瘤病理分级有关,而与患者的性别、年龄、肿瘤最大直径、TNM临床分期及病理学类型无明显相关性。结论pokemon的mRNA表达和肾细胞癌的发病及恶性程度有关,可能成为肾癌治疗的有效靶点。     

C-末端缺陷JAK3逆转录病毒载体的构建及在真核细胞中的表达

目的　以逆转录病毒 PL XSN为载体 ,构建重组逆转录病毒 C-末端缺陷的 JAK3[c- term defi-cient JAK3,JAK3(ΔC) ]载体 PL JAK3(Δ C) ,以 BAL B/ c3T3为靶细胞 ,转染 JAK3(ΔC) c DNA,检测 JAK3(Δ C)蛋白在真核细胞中的表达情况。为利用 JAK3(ΔC)对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法　用限制性内切酶法从质粒 Pc DNA3- JAK3(Δ C)中分离目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体 PL XSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体 PL JAK3(Δ C) ,通过转化感受态细菌扩增并检测 DNA序列及限制性内切酶酶切鉴定 ;用脂质体L IPOFECTAMINE介导法将 PL JAK3(Δ C)转染包装细胞 PA317细胞 ,并用 G4 18筛选抗性细胞克隆 ,收集病毒 ;用该病毒感染靶细胞 BAL B/ c3T3,G4 18筛选抗性克隆并测定病毒滴度 ;抗性细胞扩增培养 ,细胞溶解后经免疫沉淀 (IP)、Western blotting检测 BAL B/ c3T3细胞中 JAK3(Δ C)的表达情况。结果　 1重组逆转录病毒载体 PL -JAK3(Δ C)酶切和 DNA测序均表明含有 2 796 bp的 JAK3(ΔC)基因 ;2病毒滴度为 1.2× 10 4 CFU/ ml;3PL JAK3(Δ C)转染 BAL B/ C3T3细胞中表达出了 JAK3(Δ C)蛋白 ,其相对分子质量为 10 7× 10 3。结论　该研究构建的 C-末端缺陷 JAK3重组逆转录病毒载体 PL JAK3(     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在体内外的表达

目的构建猪源性胆囊收缩素(CCK)基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行表达。方法从含CCK的中介载体pMD18-T/CCK中,以限制性内切酶方法获取目的片段,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,以脂质体法转染COS-7细胞,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时采用肌肉注射法免疫仓鼠,了解重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的体内表达。结果构建了猪CCK基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,用其转染COS-7细胞后24h、48h、72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达,其中72h组荧光强度达到最强。用pIRES2-EGFP/CCK免疫仓鼠后,第4d注射部位可以检测到绿色荧光蛋白的表达,第14d荧光强度明显增强,第42d荧光强度进一步增强,正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并成功地在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行了表达,为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

稳定敲低MYH10基因细胞株的建立

目的 构建稳定敲低MYH10基因的COS-7细胞株。方法 在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高效价慢病毒感染COS-7细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后COS-7细胞MYH10蛋白表达的变化。结果 在构建的两种重组质粒中,MYH10-lentiviral shRNA-2在转染后表现出明显的干扰作用,感染后能明显下调COS-7细胞的MYH10蛋白表达。结论 病毒感染的COS-7细胞可明显抑制COS-7细胞内源MYH10的表达,说明了稳定敲低MYH10基因的COS-7细胞株的建立,为进一步研究MYH10在相关疾病中的功能奠定了基础。