小鼠β-catenin基因3'端非编码区荧光素酶报告载体的构建及其与miR-200a靶向调控关系的研究

目的构建小鼠β-catenin基因野生型及突变型重组荧光素酶报告质粒和小鼠mi R-200a过表达质粒,验证mi R-200a与β-catenin的靶向调控关系。方法采用生物信息学方法预测mi R-200a与β-catenin基因的结合位点。采用PCR法扩增小鼠β-catenin基因3'端非编码区(3'UTR)片段和pre-mi R-200a基因片段,分别克隆至p GL3-control载体和p Lenti-CMV-EGFP载体,构建野生型及突变型重组荧光素酶报告质粒。293T细胞分为6组,分别将野生型与突变型荧光素酶质粒与mi R-200a过表达质粒以及对照质粒共转染,检测6组细胞中荧光素酶的活力。结果电泳和测序结果证实成功构建小鼠β-catenin基因野生型和突变型重组荧光素酶报告质粒以及mi R-200a过表达质粒;双荧光素酶活力检测结果显示,野生型实验组相对荧光素酶活力均低于野生型对照组和阴性对照组,且差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建小鼠β-catenin基因野生型和突变型重组荧光素酶报告质粒以及mi R-200a过表达质粒,mi R-200a可以靶向抑制β-catenin的表达。     

RNA干扰对子宫内膜癌HEC-1A细胞PTTG影响的研究

目的 建立靶向垂体瘤转化基因(PTTG)干扰RNA质粒表达载体,观察对子宫内膜癌HEC-1A细胞PTTG的影响.方法 根据PTTG基因设计3对干扰序列,合成特异性干扰PTTG的siRNA片段,并与pSilencer3.0-Hl载体连接,构建3个PTTG干扰载体(pSilencer3.0-Hl-PTTG-siRNA),分别命名为PTTG siRNA-1、PTTG siRNA-2、PTTG siRNA-3.利用脂质体将其转染子宫内膜癌系HEC-1A细胞,以带有绿色荧光蛋白的真核表达质粒pSilencer3.0-Hl作为转染效率测定组,免疫荧光技术检测转染效率;应用RT-PCR 及Western blot分别检测PTTG mRNA和蛋白表达水平.结果 序列分析法证明构建pSilencer3.0-Hl-PTTG-siRNA质粒成功;RT-PCR和Western-blot分析表明PTTG siRNA-2在mRNA水平和蛋白水平特异性抑制PTTG基因的表达最强.结果 显示HEC-1A细胞阴性对照组荧光表达百分率约为5.3%,转染组荧光表达百分率为74.9%,瞬时转染效率约为69.6%,已经可以满足实验需要.结论 成功构建了靶向抑制PTTG基因的siRNA干扰载体,筛选了干扰效果最强的序列,为进一步实验打下了基础.     

微小RNA-124-3p靶向胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨微小RNA-124-3p(miR-124-3p)靶向胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响。方法 选取2015年1月—2021年1月磐石市医院保存的子宫内膜癌组织及癌旁组织20例，分析miR-124-3p在癌组织、癌旁组织中的表达及与患者临床病理特征的关系。用子宫内膜癌MFE-280细胞进行miR-124-3p沉默和过表达转染，分为空白组、miR-124-3p-inhibitor组、miR-124-3p-mimic组，分析调控miR-124-3p表达对子宫内膜癌MFE-280细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响。采用双荧光素酶报告实验预测miR-124-3p的靶基因，分析miR-124-3p对子宫内膜癌MFE-280细胞IGF2BP1表达量的影响。结果 子宫内膜癌组织miR-124-3p表达量(1.01±0.09)低于癌旁组织(1.89±0.25),差异有统计学意义(t=14.810,P<0.05)。miR-124-3p与FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移、肌层浸润深度有关，miR-124-3p在Ⅳ期、G3分级...     

微小核糖核酸-371a-5p靶向调控X相关凋亡抑制蛋白在滋养层细胞凋亡和复发性流产中的作用分析

目的探讨微小核糖核酸-371a-5p(miR-371a-5p)靶向调控X相关凋亡抑制蛋白(XIAP)在滋养层细胞凋亡、复发性流产中的作用。方法滋养层JEG-3细胞经过细胞培养、转染后,分为空白组(Control)、阴性对照组(ND)、miR-371a-5p mimics组及miR-371a-5p inhibitor组。实时荧光定量PCR检测miR-371a-5的表达观察滋养层细胞凋亡能力,免疫印迹(Western blot)检测XIAP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)表达,采用实时荧定量PCR检测XIAP、caspase-3基因。结果Control组miR-371a-5p mRNA表达水平为(1.50±0.09),NC组miR-371a-5p mRNA表达水平为(1.44±0.05),miR-371a-5p mimics组miR-371a-5p mRNA表达水平为(1.23±0.08),miR-371a-5p inhibitor组miR-371a-5p mRNA表达水平为(1.86±0.05),miR-371a-5p mimics组表达低于Control、NC、miR-371a-5pinhibitor组;miR-371a-5p inhibitor组表达高于Control、NC、miR-371a-5p mimics组(F=31.759,P<0.05)。Control组转染48 h后细胞凋亡率为(1.74±0.04)%,NC组转染48 h后细胞凋亡率为(1.76±0.06)%,miR-371a-5p mimics组转染48 h后细胞凋亡率为(3.51±0.09)%,miR-371a-5p inhibitor组转染48 h后细胞凋亡率为(1.33±0.16)%,滋养层细胞转染48 h后miR-371a-5p mimics组细胞凋亡率高于NC、Control及miR-371a-5p inhibitor组;miR-371a-5p inhibitor组低于NC、Control及miR-371a-5p mimics组(F=47.027,P<0.05)。miR-371a-5p mimics组XIAP相对表达量低于NC、Control及miR-371a-5p inhibitor组;miR-371a-5p inhibitor组XIAP相对表达量高于miR-371a-5p mimics、NC及Control组(F=33.541,P<0.05)。miR-371a-5p mimics组caspase-3相对表达量低于NC、Control及miR-371a-5p inhibitor组;miR-371a-5p inhibitor组caspase-3相对表达量高于miR-371a-5p mimics、NC及Control组(F=43.728,P<0.05)。结论miR-371a-5p靶向调控XIAP参与滋养层细胞凋亡的过程,在复发性流产起到重要作用。     

miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及机制

目的探讨miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响以及潜在的作用机制。方法设置miR-con组、miR-219a-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-219a-5p组、miR-219a-5p+pcDNA组、miR-219a-5p+pcDNA-SMC4组、miR-con+SMC4-WT组、miR-con+SMC4-MT组、miR-219a-5p+SMC4-WT组、miR-219a-5p+SMC4-MT组,转染均用脂质体法。qRT-PCR检测miR-219a-5p和SMC4 mRNA表达水平;Western Blot检测蛋白表达;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果相较于人正常皮肤细胞HaCaT,皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2、Colo-16、SCL-1中SMC4 mRNA和蛋白表达水平显著升高,miR-219a-5p表达水平显著降低(P<0.05)。过表达miR-219a-5p可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖,诱导细胞凋亡;促进Caspase-3蛋白表达,抑制Cyclin D1蛋的表达;抑制Wnt/β-catenin信号通路激活。miR-219a-5p靶向负调控SMC4的表达,转染SMC4野生型表达载体的HSC-2细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05);而转染SMC4突变型表达载体的HSC-2细胞荧光素酶活性差异不显著。且过表达miR-219a-5p,SMC4表达水平显著降低;抑制miR-219a-5p表达,SMC4表达水平显著升高。过表达SMC4能逆转miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2的增殖抑制和凋亡促进的作用。结论 miR-219a-5p可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与Wnt/β-catenin及SMC4信号通路有关,将为皮肤鳞状细胞癌的预防和治疗提供新靶点。     

miR-183在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达及其对p53蛋白的调节作用

目的探讨miR-183在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达及其对p53蛋白表达和细胞增殖、凋亡的影响。方法采用LipofectaminerTM2000脂质体将miR-183的特异性抑制剂反义寡核苷酸转染到Ishikawa细胞(实验组),不相关序列、脂质体和未转染组细胞分别为阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组。采用CCK-8法和流式细胞仪分别检测各组子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖和凋亡情况;采用RT-PCR检测miR-183和p53 mRNA在各组子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达水平;采用Western blot检测p53蛋白在各组子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达水平。结果 CCK-8检测结果显示:转染0~24 h,实验组、空白对照组、脂质体对照组子宫内膜癌Ishikawa细胞增速相似,阴性对照组子宫内膜癌Ishikawa细胞增速略快;转染24~48 h,实验组、空白对照组和脂质体对照组子宫内膜癌Ishikawa细胞增速较快;转染48~72 h,实验组子宫内膜癌Ishikawa细胞较其余3组增长速度快;转染72~96 h,4组子宫内膜癌Ishikawa细胞继续保持增长状态,且达到对数生长期,实验组子宫内膜癌Ishikawa细胞较其余3组增速快。流式细胞学检测结果显示:转染3 d后,实验组较其余3组早期凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P0.05);阴性对照组较其余3组早期凋亡率明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。RT-PCR结果显示:实验组miR-183表达水平明显低于其余3组,差异有统计学意义(P0.05);实验组p53 mRNA表达水平明显低于其余3组,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测结果显示:实验组p53蛋白表达水平明显高于其余3组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 miR-183在子宫内膜癌Ishikawa细胞中有表达,miR-183抑制剂能有效抑制miR-183在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调p53蛋白表达。miR-183可能通过抑制p53蛋白表达而抑制子宫内膜癌细胞增殖,促进凋亡,从而影响子宫内膜癌的发生、发展及预后。     

利用寡核苷酸微阵列芯片分析ERRα过度表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞转录因子活性的影响

目的:讨论过度表达雌激素受体相关受体(ERRα)对子宫内膜癌细胞HEC-1A中不同转录因子转录活性的影响。方法:构建带有绿色荧光蛋白和G418耐药基因筛选标记的真核表达质粒pEGFP-N1-3FLAG-ERRα,将质粒转染子宫内膜癌细胞株HEC-1A,荧光显微镜下检测并通过G418高浓度筛选、低浓度维持建立ERRα稳定高表达的子宫内膜癌细胞株HEC-1A/ERRα。分别抽提子宫内膜癌细胞HEC-1A、转染质粒空载体的HEC-1A/空载体细胞,ERRα过度表达的HEC-1A/ERRα细胞的核蛋白。将核蛋白与CY3、CY5双色标记的326检测信号通道的转录因子芯片(寡核苷酸微阵列芯片)杂交并通过双色共聚焦激光扫描仪分析。结果:转染ERRα真核表达质粒后,与HEC-1A细胞和转染载体的HEC-1A/空载体细胞对比,子宫内膜癌细胞HEC-1A/ERRα中ERRα的mRNA和蛋白表达明显增加。HEC-1A-ERRα细胞株与HEC-1A/空载体细胞株转录因子活性比较显示7个转录位点的活性发生显著改变,其中调控SREBP,AP-1,c-Myc,Usf-1/2转录因子的结合位点活性下调,而调控RFX-1,PPAR-α,PPAR-γ的转录因子的结合位点活性上调。而在HEC-1A/空载体细胞株和HEC-1A细胞株中未检出上述7种转录因子的差异表达。结论:①寡核苷酸微阵列芯片是一种有效的筛选转录因子的工具;②ERRα过度表达下调子宫内膜癌细胞HEC-1A中转录因子SREBP,AP-1,c-Myc,Usf-1/2的转录活性,上调RFX,PPARα,PPARγ的转录活性。     

miR-15-5p靶向调控SMAD5表达抑制子宫内膜腺癌细胞上皮间质转化的研究

目的探讨miR-15-5p抑制人子宫内膜腺癌细胞(HEC-1-A)上皮间质转化(EMT)的机制。方法构建SMAD53'-UTR-荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告基因检测,观察miR-15-5p对SMAD53'-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定SMAD5是否为miR-15-5p的靶基因。将miR-15-5p模拟物(agomir)与miR-15-5p抑制物(antagomir)及其对应的对照组分别转染至HEC-1-A细胞中,并进行EMT诱导培养,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western Blot检测各组细胞SMAD5在mRNA及蛋白水平的相对表达量;了解miR-15-5p对EMT标志物的表达影响。结果双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-15-5p可以结合在SMAD5的3'-UTR区域,而不能结合在SMAD3的3'-UTR区域,表明miR-15-5p的靶基因应为SMAD5。正常HEC-1-A细胞转染miR-15-5p的模拟物或抑制物后,SMAD5表达显著下调或上调,也表明miR-15-5p的靶基因是SMAD5。结论SMAD5是miR-15-5p的靶基因,miR-15-5p可通过靶向调控SMAD5的表达抑制人子宫内膜腺癌HEC-1-A细胞的EMT。     

Smac对子宫内膜癌细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 研究Smac高表达对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法 选择Ⅱ型子宫内膜癌HEC-1-A细胞(低分化腺癌细胞、雌激素受体阴性),应用脂质体法将Smac的过表达质粒pcDNA3.1-Smac转染HEC-1-A细胞,实验分为Smac过表达组、空载体组和空白对照组。应用qRT-PCR和Western blot法检测转染后Smac mRNA及蛋白表达情况。CCK-8法检测过表达Smac对细胞增殖能力的影响。Transwell小室侵袭及迁移实验观察细胞侵袭及迁移能力的变化。结果 Smac过表达组Smac mRNA及蛋白表达比空载体组和空白对照组明显增加(F=172.065,P=0.001;F=697.953,P=0.001)。过表达Smac后,HEC-1-A细胞增殖能力明显减弱(P<0.05)。侵袭及迁移实验结果显示,与空载体组比较,Smac过表达组穿膜细胞数均明显减少(t=9.082,P=0.016;t=6.241,P=0.013)。结论 过表达Smac可明显抑制HEC-1-A细胞的增殖,并显著减弱细胞的侵袭及迁移能力,Smac可为Ⅱ型子宫内膜癌的靶向治疗提供新的研究方向。     

miR-485-5p靶向Toll样受体4调控巨噬细胞的炎症反应

目的 探究miR-485-5p对Toll样受体4(TLR-4)的靶向作用，研究其在巨噬细胞炎症反应中的调控作用。方法 合成miR-485-5p模拟物(mimics)及其抑制剂(inhibitors),分别转染HEK-293T细胞，RT-PCR检测miR-485-5p的表达水平。根据miRNA靶向作用预测数据分析选定TLR-4作为研究的靶基因，构建TLR-43’UTR及其突变体萤火虫-海肾双荧光素酶报告基因系统，通过检测在细胞模型中过表达/抑制表达miR-485-5p后对荧光素酶活力的影响，验证miR-485-5p与TLR-4之间的靶向关系，Western blot检测TLR-4蛋白质表达水平。构建巨噬细胞模型，将miR-485-5p mimics及inhibitors分别转染巨噬细胞，RT-PCR检测靶基因TLR-4 mRNA的表达水平，ELISA检测上清中下游致病因子IL-6、 IL-17、IL-18的表达。结果 与对照组比较，转染miR-485-5p mimics后miR-485-5p表达水平升高，转染miR-485-5p inhibitors后miR-485-5p表达水平降低(P...     

Notch1基因沉默对滋养细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨Notch1基因沉默后对滋养细胞增殖与凋亡生物学功能的影响。方法:构建Notch1蛋白基因干扰质粒,体外培养人早孕期胎盘绒毛膜外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞进行转染。应用实时荧光PCR计数检测转染后Notch1 mRNA相对表达水平,CCK-8检测细胞转染后活性情况,Western blotting检测Bcl-2凋亡蛋白家族表达情况。结果:同未转染组相比,空白质粒转染组与基因沉默组mRNA相对表达水平分别为0.97±0.03、0.31±0.10,基因沉默组mRNA表达与其它两组差异有统计学意义(P<0.05)。Notch1基因沉默组同空白质粒转染组相比细胞活性明显下降(P<0.05),同时Notch1基因沉默组抗凋亡蛋白Bcl-2表达较空白质粒转染组明显降低(P<0.05),而促凋亡蛋白Bax表达明显增加(P<0.05)。结论:Notch1基因可通过调节Bcl-2凋亡蛋白家族参与滋养细胞增殖与凋亡过程,是胎盘形成发展过程中的正向调节因子。     

miR-214对HepG2细胞增殖及细胞周期影响

目的探讨miR-214对Hep G2细胞增殖及细胞周期的影响。方法 Realtime-PCR法检测肝癌细胞株SMMC-7721、Hep G2、SK-Hep-1、Huh 7、Hep3B及正常肝细胞L-02中miR-214表达量,并利用脂质体转染miR-214NC及miR-214 mimics,采用Realtime-PCR法检测转染效果;采用MTT法、流式细胞术分别检测miR-214对肝癌细胞活力、凋亡及细胞周期影响;蛋白印迹(WB)检测miR-214对肝癌细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1),细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4),生存素(survivin)及增值细胞核抗原(PCNA)表达影响。结果 miR-214在肝癌细胞SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7、Hep3B、Hep G2中表达量[分别为(1.25±0.10)、(1.43±0.10)、(0.95±0.09)、(0.98±0.01)、(0.82±0.08)]明显低于正常肝细胞L-02(2.52±0.23),其中Hep G2中miR-214表达量最低。miR-214 mimics组Hep G2细胞中miR-214表达量(2.38±0.23)明显高于miR-214 NC组(0.83±0.08),miR-214mimics组Hep G2细胞活力(0.37±0.03)明显低于miR-214 NC组(0.78±0.07);与miR-214 NC组比较,miR-214mimics组Hep G2细胞凋亡率明显升高,细胞周期阻滞于G1期,cyclin D1、CDK4、survivin及PCNA表达量下调,差异均有统计学意义(P0.01)。结论上调miR-214表达可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与调控细胞周期相关蛋白表达水平有关。     

β连环蛋白与T细胞抑制物过表达对子宫内膜癌细胞活性的影响

目的探讨β连环蛋白(β-catenin)与T细胞抑制物(ICAT)过表达对人子宫内膜癌细胞系HEC-1A活性的影响,为临床诊治提供参考依据。方法重组腺病毒载体ICAT转染HEC-1A细胞为ICAT过表达组,空白腺病毒载体转染HEC-1A细胞为空载腺病毒组,同时设置空白对照组,转染48 h后通过RT-PCR和Western blot法鉴定各组细胞ICAT表达情况;CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期,并进行Transwell细胞迁移和侵袭试验。结果转染48 h后,ICAT过表达组细胞ICAT mRNA和蛋白相对表达量明显高于空载腺病毒组与空白对照组,差异有统计学意义(均P<0.05),空载腺病毒组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。转染后第3天、第4天ICAT过表达组细胞增殖速度明显高于空载腺病毒组与空白对照组,差异有统计学意义(均P<0.01)。转染后第3天,ICAT过表达组G0/G1期细胞比例明显低于空载腺病毒组与空白对照组,S期细胞比例明显高于空载腺病毒组与空白对照组,差异有统计学意义(均P<0.01);G2/M期细胞比例在3组细胞间差异无统计学意义(均P>0.05)。Transwell细胞迁移和侵袭试验显示,ICAT过表达组迁移和侵袭细胞数明显多于空载腺病毒组和空白对照组,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论HEC-1A细胞过表达ICAT后,细胞增殖、迁移和侵袭能力明显增强,可能与ICAT过表达影响细胞周期及上皮细胞间充质转化有关。     

miR-181a对耳蜗毛细胞c-fos表达调控的研究

目的 探讨在耳蜗毛细胞氧化损伤中表达异常的miR-181a对原癌基因c-fos的生物学调控作用.方法 采用叔丁基过氧化氢(t-BHP)染毒,设50、100、200μmol/L 3个浓度组和未染毒对照组对HEI-CO1细胞染毒12h,提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用荧光定量PCR(qPCR)检测miR-181a/-181d表达;选择表达异常的miR-181a为研究对象,检索生物信息学网站,对c-fos 3'端非翻译区域(3'-UTR)上miR-181a可能的作用靶序列进行预测分析;用脂质体转染入miR-181a的mimics,qPCR检测转染效率;qPCR观察c-fos mRNA水平表达量的改变;免疫印迹(Western blotting)法观察毛细胞中c-fos蛋白表达量的改变;构建野生型的融合c-fos-3' UTR的重组pGL3质粒(pGL3-c-fos-3' UTR-WT),利用双荧光素酶报告基因检测系统检测在高表达miR-181a后荧光素酶活力的改变情况.结果 qPCR结果显示,miR-181a在100、200 μmol/L染毒浓度组表达下调,低表达倍数分别为0.744和0.766,差异均有统计学意义(P＜0.01);而miR-181d在50 μmol/L浓度组表达升高,高表达倍数为1.29,差异亦有统计学意义(P＜0.01),在100、200 μmol/L 2个染毒浓度组中的表达变化的差异无统计学意义(P＞0.05);通过预测显示,在人类和小鼠中,c-fos均受miR-181a的调控,在种子区域完全互补,靶序列在物种之间也十分保守;脂质体转染入miR-181a mimics 24h后,qPCR结果显示,在miR-181a mimics转染组中miR-181a升高892.979倍;与对照组相比,在miR-181a mimics转染组的耳蜗毛细胞中c-fos mRNA的表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blotting观察结果显示,与对照组相比,c-fos蛋白在miR-181a mimics转染组中表达升高,差异有统计学意义(P＜0.01);成功构建pGL3-c-fos-3' UTR-WT的重组质粒,双荧光素报告基因检测系统结果显示,在高表达miR-181a时,野生型pGL3-c-fos-3' UTR-WT报告载体的荧光素酶活力并未受到抑制,反而增强.结论 miR-181a对c-fos mRNA和蛋白的表达无直接抑制作用.c-fos可能不是miR-181a的靶基因,生物信息学预测结果可能是假阳性的.     

miR-3182调控肝癌细胞凋亡和放射敏感性机制研究

目的探讨微小RNA-3182(miR-3182)在肝癌细胞凋亡和放射敏感性中的作用及机制。方法实时荧光定量PCR与Western blot检测肝癌细胞系及正常肝细胞中miR-3182、FAM83A的表达;miR-3182 mimics与si-FAM83A分别转染入肝癌MHCC97H细胞,采用平板克隆形成实验检测miR-3182与FAM83A对肝癌细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测Bcl-2、Bax的表达;生物信息学预测miR-3182下游调控的靶基因,双荧光素酶报告基因实验、Western blot法进一步验证。结果 miR-3182在肝癌细胞系中表达下调,而FAM83A表达上调;miR-3182过表达或抑制FAM83A表达后细胞放射敏感性增强,Bcl-2表达下调,Bax表达上调;miR-3182可靶向结合FAM83A,并可负性调控FAM83A表达;FAM83A过表达能够逆转miR-3182过表达对肝癌细胞凋亡及放射敏感性的作用。结论 miR-3182过表达可通过靶向调控FAM83A的表达促进肝癌细胞凋亡、抑制其存活从而提高肝癌细胞的放射敏感性。     

miR-155对喉鳞状细胞癌Hep2细胞增殖影响及机制

目的探讨miR-155对喉鳞状细胞癌Hep2细胞增殖影响及具体机制。方法采用miR-155 NC和miR-155 inhibitor转染Hep2细胞,realtime-PCR法检测转染效果,细胞计数盒-8(CCK-8)法检测不同转染时间(12、24、36、48、60、72 h)细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Western blot检测Hep2细胞中细胞周期蛋白A1(cyclin A1)、cyclin D1、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/叉形头转录因子(Foxo3a)信号通路相关蛋白表达量。结果 miR-155 inhibitor组中miR-155表达量(0.34±0.03)明显低于miR-155 NC组(1.25±0.10),且转染24、36、48、60、72 h后,miR-155 inhibitor组Hep2细胞活力明显低于miR-155 NC组;与miR-155 NC组比较,miR-155 inhibitor组Hep2细胞凋亡率明显提高,细胞周期阻滞于G1期,cyclin A1、cyclin D1、PI3K、p-AKT表达下调,Foxo3a表达上调,差异均有统计学意义(均P0.01)。结论 miR-155表达下调可降低Hep2细胞活力、增加细胞凋亡率,其机制可能与miR-155调控PI3K/AKT/Foxo3a信号通路有关。     

miR-218对胃癌细胞增殖及周期影响的研究

目的 探讨miR-218对胃癌细胞增殖及细胞周期的影响.方法 将miR-218 mimics转染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803细胞,以无关序列(Scramble mimics)作为阴性对照.采用qRT-PCR技术验证miR-218 mimics转染细胞中miR-218的表达水平;通过细胞计数法及MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑,内盐]法观察miR-218过表达对胃癌细胞增殖的影响;采用流式细胞术观察miR-218过表达对胃癌细胞周期的影响.结果 转染miR-218 mimics胃癌细胞中miR-218的表达量较对照细胞显著升高.过表达miR-218的胃癌癌细胞增殖速度明显减慢(P＜0.05).通过流式细胞术分析细胞周期发现,过表达miR-218的胃癌细胞阻滞于G1期.结论 miR-218能抑制胃癌细胞生长增殖,阻止胃癌细胞周期进程,它可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用.     

干扰cyclinD1表达对前列腺癌细胞系DU145增殖及相关基因表达的影响

目的本研究探讨RNA干扰技术沉默cyclin D1的表达对前列腺癌细胞系DU145增殖过程的影响。方法设计并合成靶向cyclin D1基因的小分子干扰RNA质粒,并以脂质体介导转染入DU145细胞。用RT-PCR和Western blot检测转染前后DU145细胞中cyclin D1的表达水平。挑选干扰率最高的细胞,以MTT细胞活力检测、3H液闪掺入试验、克隆形成实验等检测各组细胞的存活率。然后采用流式细胞法检测沉默cyclin D1前后细胞周期相期的分布变化,Western blot检测细胞增殖相关调节基因p21、PCNA、Bax以及bcl-2的表达变化。结果 cyclin D1-shRNA能有效抑制cyclin D1基因的表达,其RNA和蛋白表达水平都显著下降,差异有统计学意义(P0.05);cyclin D1-shRNA则显著抑制细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05),并使其主要停滞在G0/G1期。增殖相关负调节蛋白p21和Bax表达上调,正调节蛋白PCNA和凋亡拮抗蛋白bcl-2表达则下降。结论 RNA干扰cyclin D1基因表达明显抑制前列腺癌细胞DU145的活力及增殖能力,其机制可能是通过调节胞内增殖及凋亡等相关因子而阻碍其细胞周期进程。     

miR-181b靶向鼠双微体-2对宫颈癌Caski细胞侵袭、迁移的影响及机制

目的探讨miR-181b靶向鼠双微体-2 (MDM2)对宫颈癌Caski细胞侵袭、迁移的影响及机制。方法应用RTPCR检测宫颈癌组织miR-181b mRNA表达,RT-PCR及免疫组化法检测MDM2表达。用miRcramble、miR-181b mimics、阴性对照siRNA (NC组)及靶向抑制MDM2的si NRA (si-MDM2)转染人宫颈鳞癌Caski细胞,通过转染miR-181b mimics后MDM2表达及转染si-MDM2后miR-181b表达检测初步证实miR-181b与MDM2的靶向关系,miR-NC、Wt-MDM2+miR-181b mimics和Mut-MDM2+miR-181b mimics共转染后双荧光素酶活性检测确定MDM2是否为miR-181b的靶基因。应用Transwell小室检测过表达miR-181b或抑制MDM2表达后Caski细胞侵袭及迁移能力,应用Western blotting检测MDM2、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、STAT3及p-STAT3的蛋白表达。结果 miR-181b在宫颈癌中的表达显著低于正常宫颈组织(P0. 05),MDM2在宫颈癌中的表达显著高于正常宫颈组织(P0. 05)。MDM2是miR-181b的靶基因。miR-181b mimics和si-MDM2均可抑制Caski细胞侵袭及迁移能力,下调MMP-2、MMP-9和p-STAT3的蛋白表达(P0. 05)。结论 miR-181b可靶向MDM2抑制宫颈癌Caski细胞侵袭及迁移能力,机制与下调STAT3信号有关。     

RNA干扰HMGA1基因表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及机制

目的 探讨RNA干扰HMGA1基因表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及机制。 方法 RT-PCR及Western blot检测神经胶质瘤组织中HMGA1的mRNA及蛋白表达;siRNA-NC、HMGA1-siRNA1、HMGA1-siRNA2转染人神经胶质瘤U251细胞,未转染任何siRNA作为空白对照组,48 h后检测各组细胞中HMGA1的蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、β-catenin、cyclin D1蛋白表达。 结果 神经胶质瘤组织中HMGA1基因的mRNA及蛋白表达均显著高于瘤旁组织(P<0.01);RNA干扰HMGA1基因能显著抑制其表达,HMGA1-siRNA2组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;与对照组及siRNA-NC组比较,HMGA1-siRNA组细胞存活率及Ki67、PCNA、β-catenin、cyclin D1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01)。 结论 HMGA1基因在神经胶质瘤组织中高表达,抑制其表达可通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制人神经胶质瘤U251细胞的增殖及促进凋亡。