含人组织型纤溶酶原激活剂cDNA重组逆转录病毒的制备及鉴定

将人组织型纤溶酶原激活剂ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ＬＮＳＸ重组后转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，形成完整的重组病毒颗粒，电镜下重组病毒呈散在分布，球形，直径９０～１８０ｎｍ，由囊膜、外壳和核心三部分组成。重组病毒颗粒感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，在含Ｇ４１８培养基中筛选培养２周后计数阳性细胞克隆数，结果达６×１０８ＣＦＵ／Ｌ；被感染的受体细胞ＮＩＨ３Ｔ３高效表达具有纤溶活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂。     

人组织型纤溶酶原激活剂分子生物学研究的进展

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是丝氨酸类蛋白水解酶,因它能特异地与纤维蛋白结合并受其激活,故被认为是一种高效的溶栓剂。本文结合作者的工作综述了近几年国内外在基因、蛋白质水平对t-PA进行研究的进展,深入讨论了t-PA分子结构与功能的关系,提出进行t-PA蛋白质工程以及利用抗体进行t-PA导向溶栓的可行性.     

抗单链尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备

尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕＰＡ）是近年来研究较多的溶血栓药物之一。它存在两种形式：单链尿激酶（ｓｃｕＰＡ）或称尿激酶原及双链尿激酶（ｕＰＡ）或称尿激酶〔１〕。由于临床发现ｕＰＡ大剂量注射易出现大面积出血的倾向，所以，人们对特异性强于ｕＰＡ的ｓｃｕＰＡ进行了深入地研究。由于ｓｃｕＰＡ能选择性地在纤维蛋白表面激活纤溶酶原，进而选择性地溶解血栓，而受到人们的重视。目前，我们虽已构建了高表达水平的工程细胞株，但纯化工艺有待进一步完善。鉴于国内尚未报道过ｓｃｕＰＡ单克隆抗体（ｍＡｂ）的制备，我们用常规细…     

人mUK基因转移增加哺乳动物细胞纤溶功能的研究

为探讨人小分子量尿激酶（ｍＵＫ）基因转移对哺乳动物细胞纤溶功能的影响，用制备的重组逆转录病毒颗粒感染ＣＨＬ细胞转移ｍＵＫ基因，Ｇ４１８筛选后形成的阳性克隆用免疫荧光组织化学染色和酪蛋白－纤溶酶原－琼脂糖平板溶圈法测定ｍＵＫ抗原和活性。结果证实，阳性ｃＨＬ细胞克隆持续表达具有纤溶活性的重组ｍＵＫ，其纤溶功能明显增强。     

组织纤溶酶原激活剂及其抑制物的研究进展

纤溶酶原转变成有纤溶活性的纤溶酶是纤溶过程中决定性的一步。组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔＰＡ）是体内主要的纤溶酶原激活物,而纤溶酶原激活剂抑制物（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＰＡＩ）是组织型纤溶酶原激活剂（ｔＰＡ）的快速抑制剂。近年来国内大量的研究发现,ｔＰＡ、ＰＡＩ活性或含量的变化与许多疾病,特别是心、脑血管疾病密切相关,已引起专家学者日益广泛的重视［１,２］。本文就组织纤溶酶原激活剂及其抑制剂的分子…     

人组织型纤溶酶原激活剂及其生理性抑制剂的结构与功能

一、人组织型纤溶酶原激活剂的结构和功能 人组织型纤溶酶原激活剂(Tissueplasminogen Activator,t-PA)由527个氨基酸组成,分子量约为67000,属丝氨酸类蛋白水解酶。它能使纤溶酶原(Plasminogen,Plg)变成纤溶酶(plasmin,plm),后者促使水不溶性纤维蛋白(Fibrin,Fb)水     

重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物对急性肺栓塞的溶栓疗效观察

目的：观察重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物(瑞通立,Reteplase(rPA)for InJection)在急性肺栓塞患者溶栓治疗中的疗效及安全性。方法将我院2008年10月~2014年2月收治的68例急性肺栓塞患者随机分为治疗组(48例)和对照组(20例),治疗组采用瑞通立溶栓治疗,对照组采用尿激酶溶栓治疗,比较两组在急性肺栓塞患者溶栓治疗中的有效率、死亡率及出血率。结果治疗组的总有效率为97.9%高于对照组的60.0%,有统计学意义(P<0.05)。治疗组治疗后的氧气分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)均高于对照组,有统计学意义(P<0.05)。治疗组的出血率明显低于对照组,有统计学意义(P<0.05)。结论对于无溶栓禁忌的急性肺栓塞患者,应用重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物进行溶栓治疗,快速改善肺血流动力学,具有安全性高,溶通率高,出血风险低等优点。     

单链尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备及应用

用 99%纯度的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scuPA )免疫BALB/c小鼠制备了 4株能稳定分泌抗scuPA的IgG1类单克隆抗体 (McAb )的杂交瘤细胞系G7、E8、D1和A9。检测了这四株单抗的特异性 ,它们与组织型纤溶酶原激活剂 (t PA )无反应 ,与双链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (uPA )的结合力很弱。其中G7细胞株单抗与单、双链结合的差异最大。取纯化G7单抗制备亲和层析柱。用此柱直接从培养上清纯化scuPA ,得到的scuPA纯度为 96 3% ,回收率为 85 4% ,纯化倍数 5 0倍左右 ,比活 1 2 9× 10 5。纯化方法简单、操作方便、避免了因步骤繁杂造成的scuPA的降解 ,同时降低了成本。     

组织型纤溶酶原激活剂tPA介导神经发育突触可塑性

组织型纤溶酶原激活物(tPA)广泛存在于中枢神经系统(CNS)中,介导中枢发育形成,对突触可塑性,包括突触的发生、重塑有非常重要的作用,故而可影响学习记忆功能。tPA引起学习记忆能力改变的机制,包括神经胞外蛋白水解,黏附分子的降解,神经营养因子的激活,激活NMDA受体,LRP受体等不同细胞通路。tPA主导的纤溶系统失衡后脑源性神经营养因子BDNF下降,突触可塑性的改变这一假说,为多种神经或精神类疾病开创新的治疗靶点。     

组织型纤溶酶原激活剂基因转染AGZY83-a细胞移植入小鼠体内的表达研究

目的 探讨人组织型纤溶酶原激活剂（tissue-plasminogen activator,t-PA)基因转染AGZY83－a细胞（AGZY83－a/tPA)在动物体内表达的稳定性，以及通过细胞移植方法进行t-PA基因治疗的可行性。方法 将转染t-PA cDNA的AGZY83－a细胞在G418的严格筛选下体外培养，收集细胞制成悬液，注射入小鼠体内不同部位，定期检测小鼠血浆中t-PA的含量。结果 移植后，小鼠血浆中t-PA的含量与移植前及对照组比较差异有显著性（P＜0．01），并且至少可持续105天。其中腹腔注射组表达水平最高，皮下注射组次之，两者均明显高于股四头肌注射组。结论 转t-PA基因AGZY83－a细胞移植于小鼠体内可稳定表达t-PA，并且通过腹腔和皮下植入效果好于骨骼肌植入，为临床通过细胞移植进行t-PA基因治疗提供了初步的实验依据。     

人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响

目的构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体(RV),观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中,经酶切和测序鉴定,制备高滴度的RV,以流动感染法高效感染,半固体集落培养法测定基因导入率。用嘌呤霉素筛选后,获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照,用PCR鉴定基因的导入,并测定细胞周期及凋亡率等,研究plk3基因导入对细胞的影响。结果获得pMSCV-plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率,分别达82.3%±3.70%和62.9%±4.94%(n=3)。经嘌呤霉素筛选后,转基因细胞的阳性率>99%。K562-plk3-pu-roR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低(P<0.01);而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异。与K562细胞相比较,常规培养时,处于G0~G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[(49.7±3.38)%vs(43.9±2.34)%,P=0.03]。以无血清培养基培养10h后,进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[(43.6±3.74)%vs(54.5±1.52)%,P=0.02],凋亡率降低[(1.3±0.31)%vs(3.4±0.37)%,P=0.01]。结论构建了plk3基因的逆转录病毒载体,发现plk3基因的导入可延缓细胞增殖,并抑制细胞进入增殖周期。     

神经生长因子基因重组逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建神经生长因子(NGF)基因重组逆转录病毒表达载体,研究NGF在神经干细胞(NSC)中的表达情况。方法从大鼠海马组织提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得编码大鼠β-NGF的基因片段,应用基因重组技术,将大鼠β-NGF基因片段克隆到逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1中,通过脂质体Lipofectamine2000转染包装细胞PT67,经G418筛选后,收集阳性克隆病毒上清,用于感染神经干细胞(NSC),观察该NSC表达的NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果限制性内切酶酶切分析鉴定表明为正确重组子,β-NGF基因在NSC中获得表达,该NSC的培养上清液可以促进PC12细胞突起生长。结论重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-NGF构建成功,β-NGF基因可在NSC中表达并具有生物学活性。     

携带mIL-12基因逆转录病毒载体的构建与表达

目的：构建携带小鼠IL-12（ mouse IL-12, mIL-12）基因逆转录病毒表达载体pLXmIL-12SN并检测其在B16F10细胞中的表达。 方法： 应用限制性内切酶从载体pGCp35-IRES-p40SN中酶切p35-IRES-p40（mIL-12基因片段）及将逆转录病毒载体pLXSN切开，通过连接酶连接，通过序列测定确定p35-IRES-p40基因片段正向插入载体pLXSN中的重组子，将阳性重组子转染B16F10细胞并通过RT-PCR方法检测mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结果： 成功地构建表达载体pLXmIL-12SN并可在mRNA水平检测到mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结论： 载体pLXmIL-12SN的构建成功及可在B16F10细胞中表达，为mIL-12基因治疗眼部疾病的研究奠定了基础和提供了借鉴。     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子(TFPI)与绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）与绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞（EPCs）中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子(TFPI)与绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

携带vIL-10的逆转录病毒重组体的构建及体外表达研究

目的构建携带vIL-10表达序列的重组逆转录病毒rRV-vIL-10并检测该重组病毒对体外培养的兔滑膜细胞的转染情况和目的基因的表达水平。方法①设计带有酶切位点的引物,对含有目的基因的质粒进行PCR扩增并纯化目的基因片段。②双酶切目的基因vIL-10与逆转录病毒载体pLXSN,将pLXSN与vIL-10进行定向克隆连接,筛出阳性克隆并进行鉴定。③扩增逆转录病毒重组体rRV-vIL-10,与辅助质粒pVSVG通过磷酸钙-共沉淀法共转染GP-293包装细胞,收集病毒并测定滴度。④将获得的重组逆转录病毒rRV-vIL-10转染体外培养的兔滑膜成纤维样细胞。细胞免疫组化测定目的蛋白的表达。结果①成功构建了携带治疗基因的重组逆转录病毒rRV-vIL-10,病毒滴度为5×106cfu/ml。②rRV-vIL-10能有效转染体外培养的兔滑膜成纤维样细胞,细胞免疫组化法可检测到vIL-10的表达。结论①成功构建了携带治疗基因vIL-10的重组逆转录病毒rRV-vIL-10。②以逆转录病毒为载体可以成功地将vIL-10基因导入体外培养的兔滑膜成纤维样细胞并表达vIL-10蛋白。     

锌指蛋白ZBTB20基因重组腺病毒表达载体的构建和鉴定*

 目的：构建含锌指蛋白ZBTB20基因的重组腺病毒载体,以研究锌指蛋白ZBTB20的生物学功能。方法：将带有FLAG标签的ZBTB20 cDNA片段（ZBTB20-FLAG）克隆至pAdTrack-CMV载体,将该载体与pAdEasy质粒进行细菌内同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-ZBTB20,之后在293细胞中进行包装以及扩增,并对病毒滴度进行检测;采用肝脏组织特异性ZBTB20基因敲除小鼠的原代肝细胞和肝脏组织模型,分别于离体和在体水平鉴定所制备的重组腺病毒Ad-ZBTB20介导的ZBTB20 蛋白表达情况;并采用报告基因技术检测过表达的ZBTB20蛋白的功能活性。结果：成功制备了锌指蛋白ZBTB20重组腺病毒,该重组腺病毒感染原代肝细胞和小鼠肝脏组织能过表达ZBTB20蛋白,并且此ZBTB20蛋白能抑制其下游靶基因甲胎蛋白的转录。结论：所构建的ZBTB20重组腺病毒可以介导ZBTB20的过表达并具备转录调节活性,为今后研究ZBTB20的相关生物学功能奠定了基础。