乙型肝炎病毒DNA在肝癌患者基因组中的检测

目的：为了研究乙型肝炎病毒ＤＮＡ在人类基因组中的整合作用与肝癌发生之间的关系。方法：采用聚合酶链反应技术,对肝癌细胞基因组中的乙肝病毒ＤＮＡ第Ｖ 区段进行了测定。结果：１２ 例肝癌细胞基因组８ 例为阳性,１０ 例肝癌患者外周血细胞基因组均为阴性。结论：乙型肝炎病毒ＤＮＡ 的整合与肝癌发生有密切关系。     

不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检测及其临床意义

目的探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ含量的临床意义。了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫标志不同状态的慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度及其临床意义。方法应用建立的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法定量检测慢性肝炎（ＣＨ）５１例、肝硬化（ＬＣ）３６例、原发性肝癌（ＰＨＣ）３８例的血清ＨＢＶＤＮＡ浓度。结果ＨＢＶＤＮＡ阳性的ＣＨ患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度为４．３６ｌｏｇ１０ＨＢＶＤＮＡ拷贝５０μｌ（下同），ＬＣ为４．５５，ＰＨＣ为４．４３，三组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；血清ＨＢＶ五项免疫标志均阴性或抗－ＨＢｓ阳性的慢性肝病患者中，有３７．５％患者存在低水平ＨＢＶ复制；ＨＢｅＡｇ阳性患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度总体上明显高于抗－ＨＢｅ阳性组，但其中部分患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度也很高。结论提示ＨＢＶ的复制状态与慢性肝病的病期无明显关系；在抗－ＨＢｅ阳性的患者中存在个体差异，故不能仅依据抗－ＨＢｅ阳转来判断ＨＢＶ复制减少或停止。     

不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检？…

目的 探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ含量的临床意义。了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫标志不同状态的慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度及共临床意义。方法 应用建立的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法定量检测慢性肝炎（ＣＨ）５１例、肝硬化（ＬＣ）３６例、原发性肝癌（ＰＨＣ）３８例的血清ＨＢＶ ＤＮＡ浓度。结果 ＨＢＶＤＮＡ阳性的ＣＨ患者血清ＨＢＶ ＤＮＡ浓度为４．３６ｌｏｇ１０ＨＢＶＤＮＡ拷贝／５０μｌ，ＬＣ为４．     

半巢式聚合酶链反应检测柯萨奇B组病毒方法的建立及其在病毒性心肌炎诊断中的应用

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）ＲＮＡ检测及临床常规诊断中的应用价值，从ＣＢＶ基因组５’非编码区（５’－ＮＣＲ）选择了ＣＢＶ间高度保守的三个寡核苷酸片段作为引物，建立了ＣＢＶ半巢式ＰＣＲ的检测方法。该方法对ＣＢＶ最低检出量为０．１ＴＣＩＤ５０，且对其他常见的相关病毒无扩增反应。在确定特异性和敏感性的基础上，对临床诊断或疑为病毒性心肌炎等疾病的患者进行了检测，１１１例心肌炎患者血清标本中有６２例为ＰＣＲ阳性。与ＥＬＩＳＡ检测结果相比，两种方法的阳性率分别为５６％和４５％，符合率为７７％。     

肺癌组织中人乳头瘤病毒16和18型DNA相关序列的检测

采用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）及用ＰＣＲ法制备生物素标记探针的斑点杂交法,检测５０例肺癌、１８例肺良性病及４例胎肺组织中高危险型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６、１８型ＤＮＡ相关序列,以探讨ＨＰＶ与肺癌之间发生的关系。结果３２％的肺癌组织中检测出ＨＰＶ１６、１８ＤＮＡ,其中ＨＰＶ１６ＤＮＡ阳性１０例,ＨＰＶ１８ＤＮＡ阳性５例,１例同时含ＨＰＶ１６、１８ＤＮＡ。２７例鳞癌组织中ＨＰＶＤＮＡ阳性率为４８．２％。而肺良性病组织及胎肺组织均未发现ＨＰＶＤＮＡ。ＨＰＶＤＮＡ呈阳性的肺癌患者绝大多数为重度吸烟者。提示原发性肺癌的发生可能与ＨＰＶ感染有关。     

用热启动聚合酶链反应检测血清中乙型肝炎病毒DNA技术的建立和应用

建立了热启动聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）的技术。ＰＣＲ所有反应成分被２次加样。先加Ａ液（含ｄＮＴＰｓ、一对引物和ＭｇＣｌ＿２）与一粒石蜡珠。７０℃加热后冷却至室温，使蜡珠先融化后凝固形成蜡盖封住Ａ液，然后在向其上加入Ｂ液（含耐热性ＤＮＡ聚合酶、ＨＢＶＤＮＡ模板和ＫＣｌ）并开始循环扩增。当反应管内第一次变性温度升至６０℃以上时，中隔蜡层融化，蜡上浮形成防蒸发屏障，Ａ、Ｂ两液则由于热分子运动而混匀，从而保证引物与靶基因在较高温度下严格退火以减少错导非特异性扩增和引物聚体形成。提高了ＰＣＲ的特异性和灵敏性，应用这种技术对７６例肝炎血清进行了检测，结果ＨＢＶＤＮＡ检出率为６８％，其中ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为１００％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢｅ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为７０％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢＣ（＋）血清检出率为８９％；抗ＨＢＣ（＋）血清检出率为对％；标记全阴性血清检出率为３３％。     

输血后乙型肝炎病毒感染的前瞻性研究

目的　了解输血后所致乙型肝炎病毒 (HBV)感染现状 ,以及通过检测乙型肝炎病毒表面抗原筛选献血员的效果。方法　用酶联免疫吸附测定 (ELISA)和聚合酶链反应 (PCR)分别检测了受血者和供血者血清中HBV M和HBVDNA。结果　在 5 83份供血者血中HBV M阳性 32 6份 ,HBVDNA阳性 5 7份。 136份受血者输血后 39份血清HBV M阳转 ,阳转率为 2 8 6 8% ;2 3份HBVDNA阳性 ,阳性率为 16 9%。结论　经检测乙型肝炎病毒表面抗原筛选献血员后仍有输血后乙型肝炎病毒感染的可能。     

用聚合酶链反应检测食管癌组织中人乳头瘤病毒DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对汕头市区６８例食管癌的石蜡包埋标本进行人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）ＤＮＡ序列检测，结果显示，ＨＰＶＤＮＡ总阳性率为６６．１８％（４５／６８），检出型别主要为ＨＰＶ６、１１、１６，检出率分别为２７．９４％、３６．７６％和２７．９４％，经统计学处理三型间无显著性差异；ＨＰＶ－１８及未定型别各占８．８２％。值得注意的是ＨＰＶ感染中多重感染占阳性病例的５３．３３％（２４／４５）。初步结果表明，汕头市食管癌高发区有较高的ＨＰＶ感染率，此与食管癌的发生，可能有密切关系。     

聚合酶链反应标记轮状病毒地高辛素探针的初步应用

目的为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术标记的地高辛素（ＤＩＧ）探针的特异性和敏感性。方法用聚合酶链反应技术制备地高辛素标记的人类轮状病毒（ＨＲＶ）ｃＤＮＡ探针，经ｃＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交。结果该探针具ＨＲＶ特异性，可检出１０ｐｇ的ＲＮＡ。应用该项技术检测了１２０份婴幼儿腹泻粪样标本，其阳性率为６５％，明显高于ＰＡＧＥ方法（４９．１％）的阳性率。结论ＰＣＲ方法直接制备地高辛素标记的ｃＤＮＡ探针方便、快速、特异性好、标记率高。     

聚合酶链反应杂交ELISA对肝炎患者血清HCV RNA的测定和分析

目的 应用丙型肝炎病毒（HCV）聚合酶链反应杂交酶联法（HCV－PCR－H ELISA）152份各型肝炎血清进行HCV RNA测定和分析。方法 利用标记生物素的寡核苷酸引物对患者血清进行PCR扩增,扩增产物与结合在微孔反应板的HCV特异探针快速杂交,通过抗生物素－酶联反应判定结果。结果 152份肝炎患者中,HCV RNA的检出率为57．9％（88／152）,其中抗－HCV阳性组的检出率为81．8％（72／88）。抗－HCV与HCV RNA的总符合率为78．9％（120／152）。对5例丙型肝炎患者应用α干扰素治疗者追访显示,HCVRNA的消长与抗病毒药物疗效一致。结论 HCV－PCR－H ELISA方法简便、稳定、敏感、特异,为半定量指标,可应用于HCV感染的临床诊断和抗病毒药物疗效判定。     

乙型肝炎病毒(HBV)相关性肾炎患者肾活检组织中HBV DNA分布的分子生物学检测

为探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）相关性肾炎的发病机理，应用地高辛素标记ＨＢＶＤＮＡ探针原位分子杂交（ＩＳＨ）和直接原位聚合酶链反应（ＩＳ－ＰＣＲ）技术，对２０例临床诊断为ＨＢＶ相关性肾炎患者肾活检石蜡包埋组织切片检查。在ＩＳＨ中采用ＨＢＶＤＮＡ两种探针：用全长段探针，８５％（１７／２０）ＨＢＶＤＮＡ阳性，这１７例阳性肾组织切片再用ＨＢＶＤＮＡＳ加Ｃ段探针检测，１４例阳性（８２．３５％）。在ＩＳ－ＰＣＲ中本组病例８５％（１７／２０）亦阳性。发现ＨＢＶＤＮＡ阳性颗粒弥漫沉积于肾小球毛细血管袢、系膜区、肾小管，表现形式以浆核型、核型为主。同组病例肾组织免疫组化染色法（ＬＳＡＢ）显示，ＨＢｓＡｇ与ＨＢＶＤＮＡ的存在部位基本一致。提示ＨＢＶ引起的肾脏病变不仅是免疫介导的损害，亦可能有病毒侵犯参加免疫反应。     

聚合酶链反应鉴定丙型肝炎病毒母婴传播的状态及其意义

采用多种方法，动态检测了１１例丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染的孕妇所生的婴儿血抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ。发现用合成肽酶联免疫吸附试验（ｓｐＥＬＩＳＡ）检测婴儿抗－ＨＣＶ阳性率（２３．５２％）显著低于第二代重组抗原ＥＬＩＳＡ（２ｎｄＥＬＩＳＡ）（４１．１８％）（Ｐ＜０．０５）；用２ｎｄＥＬＩＳＡ检测，６例婴儿脐血和静脉血抗－ＨＣＶ阳性，５例持续１～５月阴转，１例阳性持续１３个月。经重组免疫印迹试验（ＲＩＢＡ）鉴定，４例阳性，２例可疑阳性。用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＨＣＶＲＮＡ，５例阳性，３例于生后１～６个月自然阴转，２例持续阳性分别达９个月和１３个月。提示检测抗－ＨＣＶ判断ＨＣＶ母婴传播的状态受到婴儿抗－ＨＣＶ产生水平低下、母体抗－ＨＣＶ的被动输入和不同检测方法的影响，用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ是判断母婴传播更可靠的指标。     

套式PCR和原位杂交技术检测肝病患者单个核细胞内TTV DNA

目的　了解慢性乙型肝炎(中度)和原发性肝癌(HBsAg阳性)患者PBMC内TTVDNA存在情况。方法　采用套式PCR以及原位杂交技术检测外周血单个核细胞(PBMC)内TTVDNA。结果　套式PCR检测26例慢性乙型肝炎(中度)患者PBMC内TTVDNA阳性7例,阳性率269%,非常显著高于健康对照(χ2=143,P<0.001);21例原发性肝癌(HBsAg阳性)患者PBMC内TTVDNA阳性4例,阳性率190%,显著高于健康对照(χ2=486,P<0.05)。7例PBMC内TTVDNA阳性的慢性乙型肝炎(中度)患者PBMC原位杂交,其中4例细胞内阳性。结论　慢性乙型肝炎(中度)和原发性肝癌(HBsAg阳性)患者PBMC细胞浆内存在TTVDNA,且阳性率相当高。     

检测HBV基因组nt585位突变的特异性聚合酶链反应

目的　为调查乙型肝炎病毒(HBV)nt585位A→C变异株在国内的流行情况提供方法学。方法　根据已知的HBV基因组序列并结合国内主要流行adr和adw亚型的特点,合成在nt585位分别为A和C的2套4对引物,建立了突变特异性聚合酶链反应(msPCR)方法。结果　利用msPCR对由25份乙型肝炎免疫失败儿童患者血清和32份成人乙型肝炎患者血清扩增的HBVS基因片段进行了初步检测。结果表明该法可特异性扩增nt585为A和C的HBVDNA。结论　该法是鉴定HBV基因组nt585位A→C变异株的特异而敏感的方法。     

黄病毒逆转录—聚合酶链反应检测技术的建立和应用

为了早期快速诊断黄病毒感染，在其ＮＳ１基因序列设计了一对通用引物，扩增序列长度为４１３ｂｐ；在登革病毒（ＤＥＮ）１，２，３，４型和乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）设计了各型的内引物，扩增序列长度分别是ＤＥＮ１型为２６２ｂｐ，ＤＥＮ２型为１８９ｂｐ，ＤＥＮ３型为３９２ｂｐ，ＤＥＮ４型为９７ｂｐ，ＪＥＶ为３２３ｂｐ。应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）成功地扩增了ＤＥＮ１－４型和ＪＥＶ基因部分片段，其扩增片段的大小与设计相符合。应用套式ＰＣＲ检测临床诊断为登革热的患者血清标本７８份，证实ＤＥＮ１型阳性１８份，ＤＥＮ２型阳性４８份，其中８份同时合并感染ＤＥＮ４型。采用套式ＰＣＲ检测临床诊断为乙型脑炎患者血标本４２份，证实乙型脑炎病毒感染者３５份。结果表明，该法能直接检测发病患者早期血标本中的病毒基因，并在２天内完成对黄病毒的鉴别诊断。