中国南京庚型肝炎病毒部分基因的克隆及cDNA序列分析

采用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）从南京地区某输血后丙型肝炎患者血清中克隆出庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构区部分基因。序列分析结果表明：该序列与国外发表的庚型肝炎病毒ＨＧＵ４４４０２，ＨＧＵ４５９６６，ＨＧＵ３６３８０（ＧＢＶＣ）对应位置核苷酸序列同源性分别为８９０９％，９２１２％，８７２７％，与已报道的ＨＧＶ河北株序列同源性为９３９４％。对４０份输血后丙型肝炎血清和３０份非甲非乙非丙非丁非戊型肝炎血清进行了检测，ＨＧＶＲＮＡ阳性率分别为１０００％和６６７％。     

致倦库蚊溴氰菊酯抗性株细胞色素P450基因的克隆、鉴定及同源性分析

根据果蝇的ＣＹＰ４Ｄ１保守区氨基酸序列，设计了１对简并引物，从致倦库蚊溴氰菊酯抗性株的基因组ＤＮＡ中，扩增出１条特异性ＤＮＡ片段，其大小与设计的细胞色素Ｐ４５０基因片段相符。将这个片段与ｐＵＣ１９质粒重组，并克隆到ＤＨ５α大肠杆菌中，经筛选后测序，得到１条长４５６ｂｐ的核酸序列。将推导的氨基酸序列进行同源性分析，表明该序列与ＣＹＰ４家族成员同源性较高，提示该序列属于ＣＹＰ４家族；该序列与ＣＹＰ４Ｊ亚家族中目前仅知的３个成员的同源性分别为５１．５６％、５５．４９％、５６．２５％，进一步提示该序列可能为ＣＹＰ４Ｊ亚家族中的一员。     

致倦库蚊溴氰菊酯抗性株细胞色素P450基因的克隆,鉴定及同 …

根据果蝇的ＣＹＰ４Ｄ１保守区氨基酸序列，设计了１对简并引物，从致倦库蚊溴氰菊酯抗性株的基因组ＤＮＡ中，扩增出１条特异性ＤＮＡ片段，其大小与设计的细胞色素Ｐ４５０基因片段相符。将这个片段与ｐＵＣ１９质粒重组，并克隆到ＤＨ５α大肠杆菌中，经筛选后测序，得到１条长４５６的核酸序列。将推导的氨基酸序列进行同源性分析，表明该序列与ＣＹＰ４家族成员同源性较高，提示该序列属于ＣＹＰ４家族；该序列与ＣＹＰ４Ｊ亚家     

鸡减蛋综合征病毒55K蛋白基因的克隆与序列分析

目的了解鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）的基因结构特征。方法从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ２，经常规法提取病毒核酸后，构建了用内切酶ＨｉｎｄⅢ水解的完整基因文库，对其中Ａ片段编码５５Ｋ蛋白基因的核苷酸序列进行测定和分析。结果该读码框共１０１１个核苷酸，编码产物由３３７氨基酸组成，分子量为３８２００。氨基酸同源性分析表明，ＥＤＳＶ５５Ｋ蛋白与人腺病毒（Ａｄ２，Ａｄ１２，Ａｄ４０）、犬腺病毒（ｃａｖ）、Ⅰ群禽腺病毒（ｃｅｌｏ）同源性在２５５％～３２４％之间，而与羊腺病毒（ｏａｖ）的同源性达到４６４％。结论ＥＤＳＶ５５Ｋ蛋白基因具有与腺病毒５５Ｋ蛋白基因相似的结构，但变异较大。     

肺炎克雷伯菌耐庆大霉素钝化酶基因的克隆及鉴定

近年的细菌耐药性监测结果发现，肺炎克雷伯菌对庆大霉素等氨基糖甙类抗生素的耐药率已达４０％左右。耐药的主要机制为细菌产生Ｎ-乙酚转移酶ＡＡＣ（３）－Ｖ，使其抗菌活性不能发挥。不同菌株产生的钝化酶及其编码基因有一定的差异。作者从华山医院分离的肺炎克雷伯菌耐药株，用ＰＣＲ方法从该菌株的一分子量约８５Ｘ１０~３的接合型质粒上扩增出全长基因，连接ｐＵＣ１８，从转化子中筛选出编码乙酞转移酶ＡＡＣ（３）－Ｖ的克隆。经限制性内切酶和ＤＮＡ序列分析，并与来自粘质沙雷菌的基因比较，其核苷酸序列约有９５％的同源性，２０个氨基酸发生替换。大部分氨基酸的变异发生在Ｃ末端。该基因连接表达载体ｐＬＹ４，转入大肠杆菌ＤＨ５α和ＪＦ１１２５，后两者对庆大霉素的抗性均获得大幅度提高。     

中国湖南株丁型肝炎病毒cDNA（443－870）片段的克隆和序列分析

取１例湖南丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ阳性血清，经强变性剂法抽提ＨＤＶＲＮＡ，逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，扩增的ＨＤＶＣＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１８质粒中，获得了中国湖南株ＨＤＶＣＤＮＡ（４３３－８７０）片段克隆，ＤＮＡ测序结果显示，该片段（４３８ｈｐ长，包括一端ＰＣＲ引物２５ｈｐ）与已知的美国、意大利、法国、诺鲁和中国台湾５株ＨＤＶｃＤＮＡ相同片段比较，同源性分别为９１．３％，９４．５％，９１．３％，８４．５％和８９．３％，其中与ＨＤＶＲＮＡ复制密切相关的第一个高度保守区与美国株、意大利株和法国株完全同源。     

抗HSV糖蛋白单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

选用具有动物体内高保护作用的抗ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２型共同性糖蛋白Ｃ（ｇＣ）单克隆抗体１Ａ１２，从其杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物反转录合成ｃＤＮＡ，用一对鼠抗体通用ＶＨ引物和一对Ｖ引物进行ＰＣＲ，扩增出１Ａ１２ＶＨ和１Ａ１２ＶＬ基因，并分别克隆入ｐＵＣ１８质粒中，序列分析结果表明，１Ａ１２ＶＨ基因由３３６ｂｐ组成，编码１１２个氨基酸，隶属于小鼠重链第３组亚组（Ｄ）；１Ａ     

丙型肝炎病毒E2／NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

从北京地区１份丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中提取ＲＮＡ，经逆转录和套式聚合酶链反应扩增ＨＣＶＥ２／ＮＳ１区基因约９３０ｂｐ，将其插入至ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体中，利用双脱氧链末端终止法测出该基因５’端４３１ｂｐ的核苷酸序列，将此序列与其它９个ＨＣＶ分离株的相应序列进行比较分析，结果表明，此序列与ＨＣＶⅡ型序列同源性较高，核苷酸水平同源性在８０％以上。由其编码的ＨＣＶ外膜蛋白Ｎ端存在两个高变部位（ＨＶＲ），在ＨＶＲ内、外具有几个保守氨基酸残基和氨基酸区域，它们与外膜蛋白空间构型的维持有关。     

MOLECULAR CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF THE IMMUNOGLOBULIN LIGHT CHAIN VARIABLE REGION GENE OF A MURINE ANTI-HUMAN C1-INH IgG

获得抗体的可变区基因是由鼠源性ＭｃＡｂ制备重组抗体的前提，本实验合成与轻链可变区（ＶＬ）ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出Ｆ７ＶＬ的ｃＤＮＡ片段，并将其克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两端进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＬｃＤＮＡ是由３０３个碱基组成，编码１０１个氨基酸残基。由国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现：Ｆ７ＶＬ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＬ基因特征，同源性为６０％～８０％。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＬ基因推导的氨基酸序列应归属于小鼠Ｉｇ的ＶＬ基因ＩＶ亚组，是由Ｖｋ－Ｊｋ１重排产生。ＣＤＲ３含有９个氨基酸残基，其中含３个不相同氨基酸残基，ＶＬ大多数的氨基酸变化集中在ＦＲ１和ＣＤＲ１区，Ｆ７ＶＬ符合ＩｇＶＬ氨基酸残基变化的基本特征。Ｃｙｓ２３和Ｃｙｓ８８残基位于Ｆ７ＶＬＣＤＲ１和ＣＤＲ３的起始点，与二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＬ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下了良好的基础。     

肝病患者中庚型肝炎病毒感染的检测

目的探讨临床肝病病人中庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）感染情况及临床特点。方法应用庚型肝炎病毒基因组５’ＵＴＲ两对寡核苷酸作为引物，建立逆转录套式聚合酶链反应，检测１６９例不同肝病患者血清标本中ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ，并对其中１例ＰＣＲ扩增产物进行克隆及测序。结果１６９例各型肝病病人ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ总的检出率为９５％（１６／１６９）。在２９例有手术输血史患者中，３１０％（９／２９）ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ呈阳性，明显高于无手术输血史组（５％，Ｐ＜００１）。序列分析显示１株庚肝病毒５’ＵＴＲ部分基因片段与已知庚肝病毒株核苷酸同源性在８９１４％～９８９１％之间。结论ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染普遍存在于临床肝病患者中，病人感染ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ的临床表现未发现有特殊性，ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ可能不是非甲～戊型肝炎的主要致病因子。     

重组登革病毒E蛋白结构域Ⅲ抑制登革病毒感染的初步研究

目的 了解原核表达的登革病毒(dengue virus, DV)的E蛋白结构域Ⅲ直接抑制登革病毒感染及其抗体的中和作用.方法 在大肠埃希菌中表达1~4型登革病毒E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ).重组蛋白纯化后,进行阻断DV-2感染BHK~21细胞试验.用重组蛋白制备免疫血清,检测抗体中和作用.结果 在大肠埃希菌中成功表达了1-4型登革病毒E蛋白结构域埃希菌,4型重组E蛋白结构域Ⅲ均能够阻断2型DV感染,4型重组蛋白的免疫血清均能中和2型DV,但中和抗体效价不同.结论 原核表达的登革病毒结构域Ⅲ可以直接抑制病毒感染,所产生的抗体具有中和作用.直接抑制和中和抗体均对同型病毒作用较强.     

4株蚊媒病毒多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒的多重RT-PCR快速检测方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索GenBank国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对Mg2＋、dNTP及引物浓度,RT-PCR反应条件进行优化,建立稳定、特异的多重RT-PCR快速检测4株病毒方法 ,并以同属于黄病毒科的登革3型病毒、登革4型病毒及甲病毒属基孔肯亚病毒、辛德毕斯病毒为对照,验证其特异性。结果应用多重RT-PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ;采用多重RT-PCR引物对登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒进行扩增,分别获得574、251、879、422 bp片段,与设计相符,而对照病毒组均无非特异性扩增条带。结论实验证明,所建立的多重RT-PCR方法能够快速地检测登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒,为其检测提供了一种方便易行的方法 。     

抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的 克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果 获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105 以上.Westernblot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白.结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具.     

Liver injury caused by antibodies against dengue virus nonstructural protein 1 in a murine model

Clinical manifestations of severe dengue diseases include thrombocytopenia, vascular leakage, and liver damage. Evidence shows that hepatic injury is involved in the pathogenesis of dengue infection; however, the mechanisms are not fully resolved. Our previous in vitro studies suggested a mechanism of molecular mimicry in which antibodies directed against dengue virus (DV) nonstructural protein 1 (NS1) cross-reacted with endothelial cells and caused inflammatory activation and apoptosis. In this study, the pathogenic effects of anti-DV NS1 antibodies were further examined in a murine model. We found, in liver sections, that anti-DV NS1 antibodies bound to naive mouse vessel endothelium and the binding activity was inhibited by preabsorption of antibodies with DV NS1. Active immunization with DV NS1 resulted in antibody deposition to liver vessel endothelium, and also apoptotic cell death of liver endothelium. Liver tissue damage was observed in DV NS1-immunized mice by histological examination. The serum levels of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were increased in mice either actively immunized with DV NS1 protein or passively immunized with antibodies obtained from DV NS1-immunized mice. Furthermore, histological examination revealed mononuclear phagocyte infiltration and cell apoptosis in mice passively immunized with antibodies obtained from mice immunized with DV NS1. Increased AST and ALT levels were observed in mice passively immunized with purified immunoglobulin G (IgG) from dengue patients compared with normal control human IgG-immunized mice. The increased AST and ALT levels were inhibited when dengue patient serum IgG was preabsorbed with DV NS1. In conclusion, active immunization with DV NS1 protein causes immune-mediated liver injury in mice. Passive immunization provides additional evidence that anti-DV NS1 antibodies may play a role in liver damage, which is a pathologic manifestation in dengue virus disease.     

登革病毒悬液芯片分型检测方法的建立

目的 建立一种基于悬液芯片的登革病毒(dengue virus,DV)检测方法,可对四种血清型登革病毒进行快速检测和鉴定.方法 依据GenBank上4种病毒的基因序列信息,设计并合成相关引物及探针序列.抽提病毒RNA,经反转录后对目的基因进行PCR扩增,产物与核酸探针微球组杂交后于Bio-PlexTM 200系统检测荧光信号值.结果 DV1的悬液芯片检测敏感性约9 DNA拷贝,DV2、DV3、DV4的悬液芯片检测敏感性约90 DNA拷贝.进而将本方法用于检测15份临床标本,其检测结果与分型荧光RT-PCR一致.结论 建立了可同时检测四种血清型登革病毒的悬液芯片检测方法,为快速筛查和鉴定登革病毒提供了新的手段.