人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外联合诱导外周血单个核细胞定向分化为血管内皮细胞

目的:在体外培养的条件下,应用血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导人外周血单个核细胞向血管内皮细胞分化,解决组织工程血管化的种子细胞来源问题。方法:实验于2005-11/2006-05在安徽省立医院中心实验室完成。①血管内皮细胞生长因子(Pepro Tech公司,批号090310);碱性成纤维细胞生长因子(Pepro Tech公司,批号0704CY081);人淋巴细胞分离液Ficoll-paque(天津灏洋生物制品科技有限公司);PE标记的CD31,鼠抗人vWF单克隆抗体(BD Biosciences公司);FITC标记的兔抗鼠IgG(北京中杉金桥公司)。②无菌条件下取健康人外周血20mL,肝素抗凝,Hanks液双倍稀释,按1∶2置于淋巴细胞分离液上层,离心后提取分液层与上层交界部位呈混浊的灰白色层,即为单个核细胞层。③取离心后的细胞,向DMEM-F12培养基中分别加入含体积分数为0.2的胎牛血清、10μg/L血管内皮细胞生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。以不含血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导剂的DMEM-F12培养基作为空白对照。吹打均匀并计数,按1×1010L-1接种于25cm2培养瓶中,于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,第3天更换培养基,去除未贴壁的细胞,以后每2d换液1次。④倒置相差显微镜下观察细胞单层排列是否呈"铺路石"样结构。运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况。透射电镜观察细胞的超微结构。结果:①诱导分化后细胞形态学变化:经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上呈典型的"铺路石"样外观,经历从小圆→梭形→扁平细胞的过程,符合内皮细胞的演变过程。②诱导分化后细胞的表面标志鉴定:诱导分化20d,贴壁细胞中62.5%表达CD31,58.2%表达vWF,54.3%表达CD31/vWF。③培养细胞的超微结构观察:透射电镜下细胞胞浆内可见特征性W-P小体。结论:外周血单个核细胞在血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外联合诱导下,可分化为血管内皮细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质千细胞后bFGF目的基因的表达情况，并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法：实验于2005—03／2006—02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，构建含bFGF基因的腺病毒表达载体，利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后，将细胞接种12孔培养板，培养至90％融合时弃上清，调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果，以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后，胰酶消化，置于6孔板内，每孔细胞数量5&;#215;10^5，2d后细胞贴壁生长于盖玻片上，分别转染Ad．bFGF、Ad．GFP，同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Westem—Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达，ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果：①pcDNA3／bFGF的鉴定结果：成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad．GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定：转染48h后，绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时，腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关（P〈0．05），当〉200时转染效率趋于稳定，均在96％以上。③Ad．bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况：bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad．bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒，阳性表达率为86％，而转染Ad．GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western—Blot示转染Ad．bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad．GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad．bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng／L，此后逐渐下降，但至转染第28天时仍显著高于空白对照（441ng／L，128ng／L，t=4．31，P〈0．01）。④转染Ad．bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响：骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论：采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中，并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞

背景：骨髓间充质干细胞植入机体不同类型组织后可以分化为相应组织的靶细胞，提示机体内局部微环境可诱导和决定干细胞的发育取向，但其诱导分化条件和具体作用机制尚不清楚。目的：检测血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞的可行性。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—03／2007-01在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：健康骨髓来源于南昌大学第一附属医院内科同期收治的临床骨髓穿刺检查正常的5例住院患者，无血液系统疾病和家族遗传病史。血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Cytolab公司产品。方法：无菌条件下取健康人骨髓，采用Ficoll密度梯度离心＋贴壁法分离纯化培养骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞，诱导组加入含10μg/L血管内皮细胞生长因子、5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10％胎牛血清的DMEM培养液，对照组仅加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养14d。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学变化，免疫细胞化学染色检测CD34、Ⅷ因子的表达，透射电镜观察细胞超微结构。结果：诱导组细胞由长梭形变为短梭形和扁平形，呈内皮样细胞形态特征，CD34、Ⅷ因子均呈阳性表达，细胞胞浆内可见W-P小体。对照组细胞CD34、Ⅷ因子呈阴性。结论：血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可成功诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞。     

成纤维细胞生长因子-18在结肠癌中的表达及意义

[目的]探讨结肠癌中成纤维细胞生长因子-18(FGF-18)的表达情况及其临床意义.[方法]检测55例结肠癌患者的癌组织标本及手术切缘的正常结肠组织标本,45例结肠息肉患者的息肉标本中FGF-18的表达情况.[结果]FGF-18为细胞质着色,在结肠癌中的阳性表达率为74.5%,相对于结肠息肉中20%和切缘正常结肠组织中9.1%的阳性表达率明显升高(P<0.01).并且,FGF-18的表达与Dukes分期、组织分化程度及有无淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与患者的年龄和性别、肿瘤的大小和位置均无明显相关(P>0.05).[结论]结肠癌组织中FGF-18处于过度表达状态,与结肠癌的发生、发展和转移密切相关.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对犬牙龈成纤维细胞的影响

背景:研究发现,局部应用外源性碱性成纤维细胞生长因子可明显促进体外培养牙龈成纤维细胞的增殖,口内局部应用可加速牙龈组织伤口的愈合.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学特性的影响.设计、时间、地点:观察对比体外细胞学实验,于2008-04/09在福建医科大学细胞与发育工程中心及解放军南京军区福州总医院比较医学科完成.材料:Beagle犬4只,12月龄,体质量10～13 kg,雄性;含有人全长碱性成纤维细胞生长因子cDNA的pIRES2-EGFP-bFGF质粒为白行构建.方法:切取Beagle犬左上颌第2,3,4前磨牙的游离龈.无菌磷酸盐缓冲液冲洗4遍,将组织块剪碎后用2.5 g/L的胰酶37℃消化2 h,离心后弃上清,加入含体积分数为10%胎生血清的DMEM,接种于6孔板并覆盖玻片,置于37℃、体积分数为5%CO<,2>的培养箱培养,取对数生长期细胞消化传代.利用脂质体介导法将pIRES2-EGFP-bFGF质粒转染Beagle犬牙龈成纤维细胞,以空质粒转染组及未转染组作为对照.主要观察指标:MTT法检测牙龈成纤维细胞增殖状况;AO/EB双染色检测牙龈成纤维细胞凋亡;化学比色法检测牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性.结果:3组细胞均在转染后第3天开始进入对数生长期.MTT检测结果显示,转染后随着时间改变,与空质粒转染组及未转染组相比,实验组牙龈成纤维细胞的增殖能力明显增强(P<0.05),而空质粒转染组及未转染组差异无显著性意义(P>0.05).AO/EB双染色结果显示,实验组牙龈成纤维细胞凋亡率低于空质粒转染组及未转染组(P<0.05).转染碱性成纤维细胞生长因子基因后,牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性未见明显改变,与未转染细胞差异无显著性意义.结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转染可以加速牙龈成纤维细胞的增殖,抑制其凋亡,无促使牙龈成纤维细胞骨向分化的作用.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人牙周韧带细胞的作用

背景:主要来源于因正畸或阻生拔除的健康牙培养而成的人牙周韧带细胞已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源之一。目的:了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的人牙周韧带细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养人牙周韧带细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染,分为3组:对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR,Western blot检测人牙周韧带细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论:对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白表达;碱性成纤维细胞生长因子转染组碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多。各组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

牙周组织工程中人转化生长因子基因转染人牙龈成纤维细胞的生物学特性

目的：为早日实现利用人转化生长因子(human transforming growth factor-β，hTGF-β1)的基因治疗，研究hTGF-β1基因转染的人牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast，GF)及其培养上清的生物学特性，为牙龈成纤维细胞能否成为牙周组织工程中的种子细胞提供理论依据。方法：实验于2004—04／10在第四军医大学口腔颌面外科实验室完成。用脂质体转染法、细胞计数法、MTT比色法研究hTGF-β1基因转染人GF的增殖与分化及其培养上清对人牙周膜细胞(periodontal ligamentoells，PDLCs)及GF增殖与分化的影响。结果：与未转染组相比，hTGF-β1基因转染可显著的促进细胞增殖，并且随时间进行差异增大。转染后的GF碱性磷酸酶(ALP)活性也较对照组有显著提高(t=7．952，P&;lt;0．01)，并且与PDLCs的ALP活性接近(t=0．621，P&;gt;0.05)。转染人GF的上清与未转染人GF上清相比，可显著促进人PDLCs及GF的增殖(tPDLCs=5．745，tGF=4．621，P&;lt;0．01)．这种促增殖作用呈时间依赖性；同时使人PDLCs及GF的ALP活性显著提高(tPDLCs=6．126，tGF=5．972．P&;lt;0．01)。结论：转染人GF不仅可以诱导自身向成骨样细胞分化．而且通过旁分泌途径诱导牙龈、牙周膜细胞增殖与分化，促进牙周组织再生，为人GF成为牙周组织工程中的种子细胞提供理论依据。     

转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能

背景:传统的自体或异体骨移植治疗骨缺损都存在难以克服的缺点,基因治疗可能是一种新途径.目的:观察转染外源性血管内皮生长因子基因的人成骨细胞体外生物学特性.设计、时间及地点:对比观察,细胞学实验,实验于2005-05/2006-05在辽宁医学院科学实验中心完成.材料:人髂骨骨块取自需髂骨植骨的颈椎病患者的植骨块修洁剩余部分的骨质,患者知情同意.质粒pCDINEGF_(121)为北京大学人类疾病治疗中心马大龙教授惠赠;感受态大肠杆菌DH5a为辽宁医学院刘丹平教授惠赠.方法:体外分离和培养人成骨细胞.实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组.利用阳离子脂质体将pCDI-VEGF_(121) 真核表达质粒导入体外培养的人成骨细胞.主要观察指标:传代后1,3,5,7 d观察血管内皮生长因子在人成骨细胞内的表达,及其对人成骨细胞增殖活力和细胞分泌骨钙素和碱性磷酸酶能力的影响.结果:pCDI-VEGF_(121)真核表达质粒转染人成骨细胞后第3,7天,以反转录聚合酶链反应方法检测到其中有血管内皮生长因子mRNA表达.转染组的细胞数在第1,3,5,7天均高于对照组(P<0.05或P<0.01).培养3 d时转染组成骨细胞的碱性磷酸酶阳性率大于对照组(P<0.01);转染组的骨钙素含量高于对照组(P<0.05或<0.01).结论:血管内皮生长因子基因转染可以促进体外培养人成骨细胞的增殖能力和相应的生物学功能.     

真核表达载体血管内皮生长因子转染血管内皮细胞及对新生血管形成的影响

背景:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能与存在内皮细胞表面的特异性受体结合,刺激体内新生血管形成,但在体内半衰期极短,在移植局部难以维持足够的浓度,限制了其临床应用.目的:观察VEGF与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent,EGFP)共表达载体转染对大鼠血管内皮细胞形成新生血管的影响.设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2004-09/2005-01在中国医科大学附属第一医院器官移植实验室完成.材料:30只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只.质粒pIRES2-EGFP/VEGF165由第四军医大学提供.方法:采用层析法大量提取pIRES2-EGFPNEGF165质粒,采用阳性脂质体法进行转染,计数1×106血管内皮细胞植入雄性Wiser大鼠肾被膜下.实验组:植入转染质粒pIRES2-EGFP/VEGF165的内皮细胞:空白转染组:植入转染质粒pIRES2-EGFP的内皮细胞:对照组:植入正常大鼠血管内皮细胞.主要观察指标:①转染72 h后观察EGFP及VEGF表达情况.②流式细胞仪检测转染效率.③植入后14 d苏木精-伊红染色观察植入血管内皮细胞处组织形态学变化.结果:30只大鼠均进入结果分析.①荧光显微镜下实验组内皮细胞有特异性的EGFP表达.②流式细胞仪分析转染效率为13.06%.③实验组血管内皮细胞胞核和胞浆中均有VEGF表达.反转录-聚合酶链反应显示实验组大鼠血管内皮细胞中有人源化VEGF165基因在mRNA水平表达.④移植后14 d.实验组大鼠肾被膜下可见成团的新生毛细血管网形成,而对照组及空白转染组虽血管内皮细胞仍存活,但未形成明显血窦.结论:转染VEGF基因是促进内皮细胞早期(14d内)形成新生血管的有效途径.     

血管内皮细胞生长因子在兔骨髓基质干细胞内的表达及影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子pcDNA3/hVEGF165真核表达载体,并用脂质体法转染骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),观察血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)转染后对骨髓MSCs的生长、转化的影响。方法:采用贴壁法分离骨髓MSCs,脂质体法转染。100g/L胎牛血清DMEM培养MSCs,计数法绘制生长曲线,特殊染色观察MSCs的转化,免疫组织化学法观察转染后VEGF的表达。结果:转染了pcDNA3/hVEGF165的骨髓MSCs胞浆内出现VEGF阳性颗粒,而转染了pcDNA3组及未转染组中未出现阳性颗粒,生长曲线在3组中无明显差别。特殊染色出现的时间亦无明显差别。而且,注射有转染了pcDNA3/hVEGF165的MSCs的大白兔局部皮下血管数量增加,其他两组未发现。结论:本实验成功构建了pcDNA3/hVEGF165真核表达载体并能够在MSCs细胞内表达VEGF,其表达产物具有血管内皮增殖刺激活性。     

牙周组织工程中人转化生长因子基因转染人牙龈成纤维细胞的生物学特性

目的:为早日实现利用人转化生长因子(humantransforminggrowthfac-tor-β,hTGF-β1)的基因治疗,研究hTGF-β1基因转染的人牙龈成纤维细胞(gingivalfibroblast,GF)及其培养上清的生物学特性,为牙龈成纤维细胞能否成为牙周组织工程中的种子细胞提供理论依据。方法:实验于2004-04/10在第四军医大学口腔颌面外科实验室完成。用脂质体转染法、细胞计数法、MTT比色法研究hTGF-β1基因转染人GF的增殖与分化及其培养上清对人牙周膜细胞(periodontalligamentcells,PDLCs)及GF增殖与分化的影响。结果:与未转染组相比,hTGF-β1基因转染可显著的促进细胞增殖,并且随时间进行差异增大。转染后的GF碱性磷酸酶(ALP)活性也较对照组有显著提高(t=7.952,P<0.01),并且与PDLCs的ALP活性接近(t=0.621,P>0.05)。转染人GF的上清与未转染人GF上清相比,可显著促进人PDLCs及GF的增殖(tPDLCs=5.745,tGF=4.621,P<0.01),这种促增殖作用呈时间依赖性;同时使人PDLCs及GF的ALP活性显著提高(tPDLCs=6.126,tGF=5.972,P<0.01)。结论:转染人GF不仅可以诱导自身向成骨样细胞分化,而且通过旁分泌途径诱导牙龈、牙周膜细胞增殖与分化,促进牙周组织再生,为人GF成为牙周组织工程中的种子细胞提供理论依据。     

转化生长因子β1联合血管内皮细胞生长因子体外诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化

目的:观察胚胎干细胞在转化生长因子β1和血管内皮细胞生长因子体外诱导分化血管内皮细胞的能力,探讨提高诱导效率的方法。方法:实验于2004/2006在南昌大学医学院第二附属医院血液病研究所进行。实验材料:成年昆明小鼠由南昌大学医学院动物科学部提供(机构许可证号:96021),经自然交配怀孕。小鼠胚胎干细胞129×1/SvJ细胞系,购于ATCC公司。实验方法:取孕12.5～14.5d的胎鼠,制作小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增胚胎干细胞。将饲养层上扩增后生长状态好的胚胎干细胞以0.25%胰酶消化,小心吹打成单个细胞悬液,以差速贴壁法将饲养层细胞去掉,按1×104L-1胚胎干细胞悬液悬滴在细胞培养皿的盖上,每滴10～20μL,不换液,3d后形成拟胚体,培养液为不含白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液。挑选状态好的拟胚体分3组:转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组、转化生长因子β1 血管内皮细胞生长因子诱导组。采用RT-PCR和免疫组织化学方法证实诱导的细胞是否为内皮细胞。结果:①胚胎干细胞体外诱导生长观察:3组中拟胚体贴壁后第2天,胚体均略摊开,周围有上皮样细胞出现,第3,4天有许多卵石样细胞产生,至第6天开始出现由卵石样细胞构成的管状结构,自胚体向周围呈辐射状生长,渐呈网状,诱导时间约2周。转化生长因子β1 血管内皮细胞生长因子诱导组中产生的管样结构的拟胚体数较转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组多(44.67±3.88,28.17±6.08,33.00±2.68,P<0.05)。②RT-PCR法检测基因mRNA水平:3组基因表达的扩增片断分别为1086,733,265bp,与DNAmark相比较,条带位置相符。③扩增细胞的免疫组织化学染色:Ⅷ因子抗体反应显示阳性。结论:转化生长因子β1与血管内皮细胞生长因子均能诱导胚胎干细胞为内皮细胞,两者合用有可能提高诱导效率。     

Adenovirus-based vascular endothelial growth factor gene delivery to human pancreatic islets

Islet transplantation is limited by islet graft failure due to poor revascularization, host immune rejection and nonspecific inflammatory response. Delivery of human vascular endothelial growth factor (hVEGF) gene to the islets is likely to promote islet revascularization and survival. We used a bicistronic adenoviral vector encoding hVEGF and CpG-free allele of green fluorescent protein (Adv-GFP-hVEGF) and introduced into human pancreatic islets by transfection. We found that transfection efficiency and apoptosis were dependent on the multiplicity of infection (MOI). Compared to Adv-GFP transfected and nontransfected islets, the levels of hVEGF secreted from Adv-GFP-hVEGF transfected islets were higher and exhibit a linear relationship between hVEGF expression and MOI (10-5000). Persistent, but low level expression of hVEGF from nontransfected islets was also observed. This may be due to expression of the endogenous hVEGF gene under hypoxic conditions. The levels of DNA fragmentation determined by ELISA of islet lysates were dependent on the MOI of Adv-GFP-hVEGF. On glucose challenge, insulin release from transfected islets was comparable to nontransfected islets. Immunohistochemical staining for hVEGF was very high in Adv-GFP-hVEGF transfected islets. Weak staining was also observed for hCD31 in both transfected and nontransfected islets. These findings suggest that Adv-GFP-hVEGF is a potential candidate for promoting islet revascularization.     

骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞与血管内皮生长因子基因整合的研究

目的 大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在药物诱导下定向分化为成骨细胞,对其进行血管内皮生长因子(VEGF)基因片段转染,观察其生物学特性的变化.方法 选择MSCs体外培养的第2代细胞诱导其向成骨细胞分化,实验分为对照组和地塞米松浓度1×10-8mol/L诱导组.对诱导分化后的成骨细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定及Ⅰ型胶原的免疫组化染色、茜素红钙节结染色的鉴定.对诱导后的成骨细胞进行已构建的VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)的人5型腺病毒载体进行转染,并进行免疫组化鉴定.结果 诱导培养第3、6、9、12天的ALP活性(A405)测定,地塞米松浓度1×10-8mol/L组测定值(A值)分别为0.1 44±0.004、0.175±0.003、0.207±0.010、0.224±0.004;对照组分别为0.101±0.003、0.124±0.016、0.133±0.005、0.139±0.005.两组在组间、不同时点以及组间和不同时点的交互作用差异均有统计学意义(P＜0.05).MSCs经地塞米松的成骨诱导剂诱导7～9天可出现碱性磷酸酶染色阳性,连续培养20天后可出现茜素红钙节结染色阳性.转染后细胞VEGF免疫组化染色阳性.结论 对骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞作ad5-h-VEGF基因转染,可使诱导的成骨细胞胞浆中VEGF阳性表达.