多重荧光定量PCR技术快速诊断唐氏综合征方法的建立及临床应用

目的:建立适合中国广东地区人群特点的唐氏综合征快速产前诊断技术,并评价其临床应用价值。方法:选取21号染色体上杂合度较高的3个短串联重复序列(STR,D21S1411、D21S1412、D21S1270)作为遗传标记,采用多重荧光定量聚合酶链反应(QF-PCR)扩增技术,对广东地区106例无亲缘关系的正常人外周血DNA进行分析,计算这3个STR位标的多态性信息含量(PIC);用该方法对25例唐氏综合征患儿外周血和10例正常孕妇羊水的DNA进行检测,并与染色体核型分析结果进行对照分析。结果:21号染色体上的3个STR(D21S1411、D21S1412、D21S1270)的PIC分别为0.913、0.835、0.856,确立了QF-PCR产前诊断唐氏综合征的方法。对25例唐氏综合征患儿外周血和10例孕妇羊水同时进行QF-PCR检测与染色体核型分析,两种方法均检测到27例唐氏综合征,结果吻合。结论:本研究所选STR位标在中国广东人群中呈现较高的遗传多态性,符合Hardy-W e inberg平衡定律;所构建的QF-PCR技术产前诊断唐氏综合征具有准确、快速、高效等特点,有较高的临床使用价值。     

利用21号染色体上STR位点进行唐氏综合征基因诊断的研究

[目的]探讨利用21号染色体上STR位点进行唐氏综合征基因诊断的可行性,建立一种快速、准确、简便的唐氏综合征基因诊断方法.[方法]以18例唐氏综合征为研究对象,选择21号染色体上3个STR位点(D21S2052、D21S2054、D21S1446),对外周血DNA进行PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据STR位点出现三条密度定量之比为1:1:1带型(完全杂合型)或两条2:1带型(半杂合型)诊断唐氏综合征,与此同时以细胞遗传学染色体核型分析作为对照.[结果]18例患者在3个STR位点全部出现1:1:1带型或2:1带型,基因诊断结果与染色体核型分析一致.[结论]21号染色体上3个STR位点的基因分型和PCR扩增方法,快速、准确、简便,可用于唐氏综合征基因诊断.     

实时定量PCR扩增21号染色体小串联序列和S100B基因快速产前诊断21三体综合征

唐氏综合征是最常见的染色体异常性疾病,95%的唐氏综合征患者发现是21三体,目前使用绒毛样本、羊膜穿刺、脐带穿刺的方法进行唐氏综合征的产前诊断,但这些方法的缺点是花费高、细胞培养困难并且需要较长时间。这些限制促使我们寻找新的方法诊断21三体。最近,开展了各种不同的方法探测21号染色体的另外一条拷贝,如荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链反应(PCR)。根据以前的报道,位于21号染色体上的D21S167基因(定位于21q22.2基因位点)和S100B基因(定位于21q22.3基因位点)可以作为PCR的目的基因,用于产前诊断21三体。研究的目的是用唐氏综合征…     

FISH技术在诊断唐氏综合征及植入前遗传学诊断中的临床应用

目的:探讨优化现有荧光原位杂交(FISH)技术用于产前诊断唐氏综合征及其单细胞植入前遗传学诊断(PGD)的临床应用价值。方法:应用21号和X染色体特异性荧光素标记的双色混合探针对正常人体标本和25例唐氏综合征患儿外周血以及10例血清筛查阳性孕妇羊水进行FISH分析,同步进行羊水细胞培养,行常规细胞染色体核型分析,并以核型分析结果为金标准,建立一套稳定的FISH方法。在常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术方法基础上,用该方法分别对13例未受精卵、卵裂球进行唐氏综合征遗传学诊断。结果:正常羊水间期细胞和拟诊唐氏综合征羊水间期细胞经FISH分析,结果与染色体核型分析的结果一致,符合率100%。结论:建立的FISH方法具有快速、简便、准确性高、特异性强的特点,是快速进行产前唐氏综合征筛查及扩大PGD技术应用的简易可靠技术,有很好的临床应用价值。     

PCR-AFLP技术产前诊断唐氏综合征

目的 :建立临床可行的、高准确性的、快速产前诊断唐氏综合征的方法。方法 :应用聚合酶链反应—扩增片断长度多态性技术 ,选择 2 1号染色体上 4个具有高度多态性的 STR位点对 12例胎儿进行了产前诊断。结果 :在 12例胎儿的产前诊断中 ,检出 2例唐氏综合征患儿 ,与细胞遗传学检查结果一致 ,无假阴性和假阳性病例发生。结论 :选用 2 1号染色体上的 4个 STR位点具有高度的多态性 ,应用 PCR- AFL P技术检测各位点的基因型状况 ,产前诊断经典型和易位型唐氏综合征胎儿 ,准确性高 ,操作简便、快速 ,具有极好的临床应用价值。     

PCR-AFLP技术产前诊断唐氏综合征

目的:建立临床可行的、高准确性的、快速产前诊断唐氏综合征的方法.方法:应用聚合酶链反应一扩增片断长度多态性技术,选择21号染色体上4个具有高度多态性的STR位点对12例胎儿进行了产前诊断.结果:在12例胎儿的产前诊断中,检出2例唐氏综合征患儿,与细胞遗传学检查结果一致,无假阴性和假阳性病例发生.结论:选用21号染色体上的4个STR位点具有高度的多态性,应用PCR-AFLP技术检测各位点的基因型状况,产前诊断经典型和易位型唐氏综合征胎儿,准确性高,操作简便、快速,具有极好的临床应用价值.     

利用母血中胎儿有核红细胞结合血清筛查和三维超声无创性产前诊断唐氏综合征

目的:利用母外周血中胎儿有核红细胞结合血清三联筛查及三维超声,建立快速无创性产前诊断唐氏综合征的有效模式。方法:早、中期孕妇共670例,采取血清三联筛查结合三维超声和病史选取唐氏高危孕妇,抽取高危孕妇的外周血,流式细胞术富集母血中的胎儿有核红细胞(Fetal Nucleated Red Blood Cells,FNRBCs);次日进行多重引物原位杂交(muti-primed in situ labeling,multi-PRINS)检测胎儿细胞21号染色体与Y染色体。结果:通过血清三联筛查和三维超声结合病史筛选出高危孕妇24例,高危孕妇在两日内即可确诊,24例中诊断23例染色体正常胎儿,包括男胎12例、女胎11例;诊断1例男性唐氏综合征胎儿。24例标本检测结果和实际胎儿核型符合。结论:血清三联筛查、超声检查结合病史筛选出高危孕妇,然后利用母血中胎儿有核红细胞进行多重引物原位杂交检测细胞染色体,可作为快速、无创性产前诊断唐氏综合征的有效模式,并可为其他胎儿染色体基因异常或者宫内感染的无创性产前诊断提供参考。     

同源基因定量聚合酶链反应条件的优化

目的探讨同源基因定量聚合酶链反应（PCR）的最佳反应条件。方法用两种PCR仪分别扩增正常人位于唐氏综合征致病关键区域的人肝型磷酸果糖激酶基因（PFKL）和人肌型磷酸果糖激酶基因（PFKM）。结果两种PCR仪的最佳退火温度分别是64℃和60℃,且只有在此反应条件下PFKL和PFKM的电泳条带光密度值具有一致性。结论不同的PCR仪器检测唐氏综合征扩增条件也不同。     

孕中期唐氏筛查及产前诊断结果分析

目的:探讨孕中期唐氏筛查及产前诊断对检出胎儿染色体异常和出生缺陷的价值.方法:选取产前检查的孕中期妇女4090例,采用全自动化学发光免疫分析法进行血清标记物AFP、free-hCG以及uE3三标记检测,并采用产前筛查软件计算发生唐氏综合征的风险.对唐氏综合征高风险孕妇(唐氏筛查风险切割值≥1:275)在其怀孕的18~22周进行羊膜腔穿刺,抽取羊水进行胎儿染色体核型分析,同时做好受检者的追踪工作.结果:4090例孕妇中有237例孕妇经筛查确定为唐氏综合征高风险,阳性率为5.79%(237/4090),其中76例(32.07%76/237)接受羊水穿刺或是脐血穿刺检查,结果显示9例为胎儿染色体异常,占11.84%(9/76);唐氏筛查低风险组(唐氏筛查风险切割值<1:275)和高风险组之间的出生缺陷发生率差异均存在统计学意义(P<0.05).结论:孕中期唐氏筛查及产前诊断对检出胎儿染色体异常和出生缺陷的价值显著,值得在临床上进一步推广应用.     

全染色体涂染探针FISH技术在AIH产前诊断唐氏综合征的应用

目的:探讨应用自制的人21号全染色体特异DNA涂染探针FISH技术在AIH产前诊断唐氏综合征的应用价值。方法:对经AIH治疗成功受孕的妊娠16～26周孕妇抽取的未培养羊水细胞采用已制备的人21号全染色体特异DNA涂染探针进行荧光原位杂交,同时进行常规细胞培养及染色体核型分析,并比较两种检测方法的结果。结果:自制探针FISH检测均于24 h内出结果,检测出患儿2例,其中1例为标准21三体,1例为X三体。自制的人21号全染色体特异DNA涂染探针对未培养的羊水细胞核21号染色体的符合率高达99.42%,染色体核型分析为47,XXX的患者FISH结果未见异常。检测结果与染色体核型分析及随访相符。结论:人21号全染色体特异DNA涂染探针FISH技术具有快速、准确的优势,大大提早诊断时间,应用于AIH成功受孕高危孕妇的产前筛查唐氏综合征中具有良好的应用价值。     

PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值

目的：探讨PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值。方法：对1486例疑为泌尿生殖道感染患者分别采用PCR反向膜杂交法及荧光定量PCR（FQ—PCR）检测，并将检测结果与培养结果比较。结果：FQ—PCR检测CT、UU、NG阳性率高于培养法，比较差异有统计学意义（P〈0．01）；PCR反向膜杂交法与培养法及FQ—PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义；PCR反向膜杂交法、FQ—PCR检测敏感性比较差异无统计学意义，但PCR反向膜杂交法检测特异性高于FQ—PCR，比较差异有统计学意义（P〈001）。结论：PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确，快速，且筛查特异性高于F0-PER，值得临床推广适用。，     

TaqMan-MGB探针法快速检测脑膜炎奈瑟菌的研究

目的建立TaqMan-MGB探针荧光定量PCR快速检测脑膜炎奈瑟菌（Nm）方法,为流脑的诊断提供更加灵敏、特异、可标准化、自动化的检测方法;评价TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法在健康人群带菌调查中的应用价值。方法根据Nm ctrA基因的3端保守序列设计合成引物和TaqMan-MGB探针,建立快速检测脑膜炎奈瑟菌的荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测脑膜炎奈瑟菌的灵敏度为102cfu/ml,TaqMan-MGB探针法检测900份健康人群咽拭子标本,阳性34例,检出率3.8%,高于培养法（1.2%）。结论该方法特异性强、灵敏度高,能实现脑膜炎奈瑟菌的快速检测,适用于健康带菌检查并可作为临床常规诊断方法的补充,有利于流脑的早诊断、早治疗。     

实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的结果分析

目的分析实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的临床意义。方法用实时荧光定量PCR的方法检测正常胃黏膜、胃癌原发灶、胃癌转移灶组织中TwistmRNA的表达含量。并以Twist基因和18stRNA含量的比值作为评价Twist表达水平的指标,组间进行配对t检验。结果Twist／18stRNA（10g比值）正常组为0．139±0．003;原发组为0．304±0．046;转移组为0．654±0．015。原发性胃癌组织及转移组织中Twist基因表达水平与正常胃黏膜组织比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;转移组与原发组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Twist基因在正常胃黏膜组织中表达量较低,在胃癌及其转移组织中表达水平较高,而且Twist基因的表达水平与胃癌转移程度存在一定相关性。可以辅助诊断和观察胃癌术后疗效。     

妊娠期糖尿病母婴血清及胎盘内脂素变化及其与胎儿生长发育的相关性研究

目的：探讨妊娠期糖尿病（GDM）母婴血清内脂素水平、胎盘及网膜脂肪组织内脂素基因表达及其与胎儿生长发育的关系。方法：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定40例妊娠期糖尿病及55例正常孕妇母血清及新生儿脐血血清中内脂素水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测两组胎盘及网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达。结果：（1）GDM组孕妇产前BMI、孕期体重增长、新生儿出生体重高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;（2）GDM组孕妇血清内脂素水平显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0,05）;GDM组新生儿脐血血清内脂素水平显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;组内比较,两组脐血内脂素水平均显著高于母血内脂素水平,差异有统计学意义（P〈0．05）;（3）两组胎盘组织内脂素mRNA表达有显著差异,双△Ct法进行相对定量分析,GDM组内脂素mRNA表达量是对照组的7．826倍;两组网膜脂肪组织内脂素mRNA表达比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：GDM孕妇血清及脐血内脂素水平的升高可能参与了GDM的发生发展以及胎儿宫内发育的调节,循环中内脂素的变化主要来自于胎盘内脂素基因表达的变化。     

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物,建立染料法(SYBR green I)实时荧光定量PCR,评估其灵敏性及特异性;并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2=0.99),灵敏性评估显示20μl体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测,最低检出浓度为2拷贝/μl,比普通PCR检测方法提高1~2个数量级,并且具有较好的重复性;建立的SYBR I染料法具有良好的特异性,与立氏立克次体R株等其他5种立克次体,以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增;用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器,以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测,其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体检出量最多,肝脏和肾脏次之,血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性,适合各种样本中东方体的快速检测,可用于实验室的快速诊断。     

中枢神经系统CT影像诊断专家系统的设计与实现

目的：探讨专家系统在辅助中枢神经系统疾病的CT影像诊断中的价值。方法：根据影像诊断观察习惯,选取20个指标,建立中枢神经系统影像诊断知识库,并根据公认的发生概率设置各征象的初始值。采用VFP9.0数据库语言编程。选取三甲医院有完整临床和影像学资料并经病理证实的术前误诊病例共173例,分别由两名三甲医院副主任医师（第一组）共同阅片,根据经验进行讨论并达成一致,作出诊断;由一名副主任医师（第二组）和一名住院医师（第三组）分别将上述病例的相关信息输入专家系统,记录所得结果。各组间阅片结果采用字2检验。结果：第一组诊断准确率为37.57%（65/173）,第二组诊断准确率为63.01%（109/173）,第三组诊断准确率为46.89%（81/173）。经统计学处理表明,第二组与另外两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。第一组与第三组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：将专家系统融入中枢神经系统CT影像诊断具有重要的实用价值。     

MSCTA在脑血管病变中的诊断价值

目的：探讨64层螺旋CT血管成像（MSCTA）在脑血管病变中的诊断价值。方法：回顾性分析本院收治的60例疑似脑病变患者的l临床资料,对其进行MSCTA检查,将获得原始数据图像传送到工作站上行容积重建（VRT）、多平面重建（MPR）及最大密度投影（MIP）图像后处理重建,分析其病变情况。并以数字减影血管造影（DSA）检查为金标准,分析其诊断率。结果：MSCTA能够较清楚的显示颅内血管情况,动脉狭窄有22例,动静脉畸形18例,动脉瘤12例,无异常8例。MSCTA诊断结果与DSA一致。结论：MSCTA是一种安全、快速、无创的脑血管病变的检查方法,准确性较高,可作为首选的检查方法。     

外周血淋巴细胞G显带高分辨染色体制片效果量化评价

目的：建立一种量化的染色体制片质量评价标准。方法：随机选取2016年9月—2017年3月于深圳市龙岗区妇幼保健院行外周血染色体检测的受检者233例，同时使用常规方法以及高分辨制片法进行细胞培养、制片及核型分析。通过核型中15个质评条带能否清晰识别对每个样本进行制片效果的评分，比较中低分辨组和高分辨组的评分。结果：高分辨方法评分高于中低分辨方法，差异有统计学意义（P＜0.05）。高分辨组染色体形态清晰，带纹丰富，长度适中，分散适度。结论：基于15条质评条带进行质量评价可量化地评估染色体的制片效果，便于染色体核型分析的室内质控和室间质评，具有临床应用价值。     

斑点热群立克次体实时荧光定量PCR检测方法的 建立及应用

摘要:目的　探讨实时荧光定量PCR快速检测斑点热群立克次体标本的应用价值。方法　根据斑点热群立克次体外膜蛋白A（OmpA）基因保守序列设计TaqMan特异性探针和引物,进行实时荧光定量PCR方法学评估,并同时运用该法和普通PCR法对对海南省2012年不明原因发热病人157份血标本进行斑点热群立克次体的检测及结果分析。结果　本研究建立的定量标准曲线循环阈值（Ct值）和模板拷贝数呈良好的线性关系（R2值为0.998）。该法能检出斑点热群立克次体阳性标准品—西伯利亚立克次体（R.sibirica）最小浓度为102 copies/μl,灵敏度比普通PCR高100倍。用该法检测斑点热群立克次体DNA,结果为阳性,检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、致泻性大肠埃希菌和副溶血弧菌等其他病原细菌DNA结果均为阴性。采用实时荧光定量PCR法对实验室库存的发热病人血标本DNA进行回顾性检测,结果示阳性2例,检出率为1.2%（2/157）,而普通PCR检测结果均为阴性。结论　实时荧光定量PCR法具有快速、特异和灵敏的优点,在处理突发公共卫生事件中可发挥快速检测的优势,在斑点热诊断中具有重要的临床意义。     

实时荧光PCR检测风疹病毒的应用研究

目的建立风疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的快速检测。方法分析近四十年来流行的风疹病毒E1基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立风疹病毒实时荧光PCR检测方法。对30例临床诊断为风疹的患者标本进行实时荧光PCR检测,并与血清学检测结果进行比对。结果 30例患者标本中实时荧光PCR检测,27份阳性,3份阴性,阳性率为90.0%,远高于血清学检测(阳性率70.0%)。结论该方法具有方便快捷、特异性强、敏感性高等特点,为风疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供了技术支撑。