CYP3A4和CYP2B6药物诱导剂体外筛选体系的建立

目的构建CYP酶药物诱导剂的体外筛选技术平台。方法利用双荧光素酶报告基因系统,将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP3A4和2B6启动子序列插入报告基因上游,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,用含有利福平或DMSO培养基培养48h后裂解进行双荧光素酶活性检测。结果经利福平处理的细胞裂解物荧光素酶比活性值与阴性对照组和溶剂组差异显著。结论本研究构建的CYP3A4和2B6体外筛选平台,可以有效地用于体外诱导剂的筛选。     

CYP3A4内含子10对CYP3A4基因表达的增强子作用

目的 探讨CYP3A4内含子10及其内SNP CYP3A4*1G对CYP3A4基因表达的调控作用.方法构建CYP3A4启动子启动转录的CYP3A4真核表达质粒, 将CYP3A4内含子10 (CYP3A4*1G野生型/突变型) 正向或反向插入该质粒的启动子上游, 从而构建出不同基因型、不同方向的CYP3A4内含子10调控的CYP3A4真核表达质粒.将构建好的各质粒分别转染入Hep G2细胞, 应用实时荧光定量PCR方法检测CYP3A4 m RNA表达水平.结果 构建的重组质粒经酶切验证与测序鉴定, 插入片段的序列和方向与预期完全一致.无论CYP3A4*1G野生型还是突变型, 反向组CYP3A4 m RNA表达水平均高于正向组 (P<0.01) ;而CYP3A4内含子10无论是正向还是反向, CYP3A4*1G野生型组CYP3A4 m RNA表达水平均高于突变型组 (P<0.01) .此外, 正向突变组CYP3A4 m RNA表达水平低于阳性对照组, 不但没有增强CYP3A4启动子的转录作用反而有所减弱.结论CYP3A4内含子10有类似于增强子的功能, 能够影响CYP3A4启动子对CYP3A4基因的转录, 且具有方向性和CYP3A4*1G等位基因依赖性.     

银杏叶及其化学成分对CYP3A4和CYP2C9影响的研究进展

银杏叶是临床上使用广泛的中草药之一,主要化学成分包括黄酮类和萜类内酯两大类。近年来,国内外大量的研究表明银杏叶及其化学成分能够影响细胞色素P450酶的表达,并通过细胞色素P450酶影响其他药物的代谢。现从银杏叶及其化学成分对CYP3A4和CYP2C9的影响,及其通过CYP3A4、CYP2C9影响其他药物代谢等方面进行综述。     

CYP3A4＊1G基因多态性及功能的初步探讨

采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4＊ 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4＊ 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示,pGL3-promoter-A质粒转染后荧光素酶活性显著高于pGL3-promoter-G（P=0.022＜ 0.05）. CYP3A4＊ 1G能够增强荧光素酶基因的表达,可能增强CYP3 A4基因的转录活性.     

慢性肝胆疾患P450同工酶CYP3A4表达的改变

目的:研究肝硬化和黄疸患者肝脏中CYP3A4蛋白含量、活性及其mRNA表达,进一步探讨其药理学意义.方法:提取肝炎后肝硬化、阻塞性黄疸及肝血管瘤患者的肝组织标本,以后者为正常肝组织对照;Nash法测定CYP3A4酶活性,ELISA法测定蛋白量,一步法抽提肝组织总RNA,随机引物标记法制备CYP3A4 cDNA探针,Northern杂交比较CYP3A4基因在以上三组中的表达差异.结果:肝炎后肝硬化患者CYP3A4蛋白量、活性及mRNA表达较正常肝显著降低(P<0.01),而阻塞性黄疸患者该酶改变与正常肝相差无显著性.结论:肝硬化患者CYP3A4 mRNA表达显著降低,导致同工酶含量和酶活性下降,肝脏对包括静脉麻醉药物在内的多种药物的代谢能力下降,提示临床麻醉工作中应考虑药酶改变,减低患者的麻醉药剂量.     

药物代谢中的CYP3A遗传学

大多数药物可被CYP3A酶代谢,这些酶在表达水平方面的变化将决定患者产生积极的或不良的药物反应。产生CYP3A表达的个体差异的作用机制几乎不被认知,但人类基因组顺序图谱的变异将促进答案的寻找。所有活的生物体(包括人类)都会持续不断地暴露于大约10000种存在于食物、饮料和环境中的化学物质。许多天然化合物是有毒的,如存在于大多数潜在致癌物中的霉菌黄曲霉毒素。各种防御机制已进化到可保护生物体不受其影响,其中尤为重要的细胞色素P450酶是一种由血红素携带的以催化     

黄芩苷对Chang Liver细胞CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19表达的影响

目的 在Chang Liver细胞中观察黄芩苷处理对CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19表达的影响.方法 在Chang Liver细胞中分别加入DMSO 0.1% (v/v) (溶剂对照) 和不同浓度的黄芩苷 (0.01、0.1和1 μM) 24、36和48h后,用半定量RT-PCR的方法分别检测CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19表达量的改变.结果 用不同浓度黄芩苷分别处理Chang Liver细胞24和36 h,CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19的表达均呈现出增强的趋势;但是黄芩苷处理48 h后各浓度对CYP3A4和CYP2C9的表达产生显著的抑制效应 (P<0.01) . 结论黄芩苷对细胞中CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19的表达具有影响作用,这种影响作用随药物处理时间不同而表现出双向效应.     

中国汉族人群CYP2D6、CYP3A4 SNP位点基因多态性分析

目的：通过对药物代谢酶CYP2D6和CYP3A4的相关单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）筛选检测,获得其在中国汉族人群中遗传多态性分布的相关数据。方法：筛选11个关于CYP2D6、CYP3A4基因的SNP位点,取192份中国汉族无关个体健康自愿者的血液样本获得基因组DNA,根据单碱基延伸技术通过 GenomeLabTM SNPstreamR 基因分型系统进行SNP分型。结果：本次检测的11个SNP位点在研究人群中全部具有多态性（最小等位基因频率>0.01）,其中7个SNP（RS28624811、RS28670611、RS9623531、RS5758589、RS3735451、RS2246709、RS2404955、RS4646440）位点的等位基因频率在此人群与白种人相比差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：汉族人群可能有继承特定的遗传信息,导致与其他人群具有不同药物代谢率。     

宁夏回族人群CYP3A4*6等位基因多态性的研究

目的 了解宁夏回族人CYP3A4第9外显子的分布特点,为宁夏回族患者使用CYP3M底物药物提供参考依据.方法 收集到180例回族人群血样,应用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增人CYP3A4第9外显子基因序列,对其进行测序;同时扩增产物用限制性内切酶HinfⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP)图谱.结果 运用PCR-RHLP法分析了150例正常回族人、30例高脂血症回族志愿者基因的突变情况,发现有2例第17776位点有A插入引起移码突变,使2例杂合子CYP3A4基因第9外显子提前出现终止密码子.其中野生型纯合子频率为98.9%,杂合子频率为1.1%,突变型纯合子频率为0,突变等位基因频率为0.005.结论 本研究得到了CYP3A4第9外显子基因多态性在宁夏回族人群中的分布情况,为研究CYP3A4第9外显子基因多态性与临床药物效应的相互关系奠定了基础.     

CYP2C19、CYP3A4基因多态性与十二指肠球部溃疡疗效的关系

目的检测肝脏细胞色素氧化酶CYP2C19、CYP3A4的基因多态性,并观察不同基因多态性患者予奥美拉唑治疗十二指肠溃疡的疗效,以明确CYP2C19、CYP3A4基因多态性对药物治疗效果的影响。方法65例十二指肠溃疡患者分别检测CYP2C19、CYP3A4基因多态性及幽门螺杆菌（Hp）,予奥美拉唑治疗及根治Hp治疗,观察治疗后腹痛缓解情况,并复查胃镜,观察溃疡缩小情况。结果在65例患者中,CYP2C19t3基因野生型为43例（66．15％）,突变型为12例（18．46％）,杂合型为10例（15．38％）,CYP3A4＊18未见基因多态性。CYP2C19＊3突变型腹痛缓解时间短于野生型及杂合型（P〈0．01）。治疗后2周CYP2C19＊3突变型患者溃疡缩小率大于野生型及杂合型（P〈0.01）,但治疗后4周无明显差异（P〉0．05）。结论在观察病例中可见CYP2C19基因多态性,未见CYP3A4基因多态性,CYP2C19基因多态性影响奥美拉唑治疗十二指肠溃疡的疗效。     

酮康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶3A4、1A2活性的作用

目的 观察酮康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶3A4、1A2活性的作用,为临床上安全有效地联合用药提供实验依据.方法 采用健康成人肝细胞微粒体,分为对照组和处理组.酮康唑处理组分别加入不同浓度的酮康唑1 ml,对照组仅加入培养液,孵育15 min后再加入CYP450同工酶3A4和1A2的相应底物(分别为睾酮和非那西丁)再孵育20 min.反应终止后用高效液相色谱仪测量代谢产物(分别为6β-羟基睾酮与对乙酰氨基酚)的生成量,分别代表3A4和1A2的活性.结果 细胞色素P450同工酶3A4的相对活性百分比减小到对照组50%时(IC50)酮康唑的质量浓度为0.16mg/L.而同工酶3A4的相对活性百分比随质量浓度酮康唑增加逐渐减小,各处理组与对照组比较差异均有显著性意义(P＜0.05).低剂量细胞色素P450同工酶1A2的相对活性百分比处理组与对照组比较明显降低(P＜0.05),高剂量细胞色素P450同工酶1A2的相对活性百分比处理组与对照组比较则明显升高(P＜0.05).结论 酮康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶3A4的活性有抑制作用.然而对细胞色素P450同工酶1A2的活性则是低剂量有抑制作用,衙高剂量有诱导作用.     

硝苯地平对人孕烷X受体介导的CYP286和CYP2C9的转录调节作用

目的 建立hPxR介导的CYP286、CYP2C9药物诱导剂的体外筛选体系,分析硝苯地平诱导CYP286、CYP2C9的分子机制.方法 利用双荧光素酶报告基因系统,将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP286和2C9启动子序列插入报告基因上游,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,以10μM利福平为阳性对照,用1、5或10μM硝苯地平处理48h后裂解细胞进行双荧光素酶活性检测;或用10μM硝苯地平分别处理细胞12、24和48h后进行双荧光素酶活性检测.结果 硝苯地平激活hPXR的起始浓度为1～5μm,在5μm浓度下,硝苯地平诱导CYP286和2C9表达增加3.93和3.59倍,与DMSO溶媒组差异存在显著性(P<0.001),在10μm硝苯地平作用下,CYP286和2C9表达分别增加6.23和5.24倍,与溶媒对照组和5IXm浓度组差异都存在显著性(P<0.001).10μm硝苯地平处理12 h后即能显著地诱导CYP286和CYP2C9表达增强,但其诱导倍数与24和48 h组差异存在显著性(P<0.001).结论 该研究成功构建了hPXR介导的CYP286和CYP2C9药物诱导剂的体外筛选体系;硝苯地平通过激活hPXR介导了CYP286和2C9的表达上调,并表现出明确的剂量-效应关系.     

隐丹参酮对细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2C9的影响

目的 研究丹参中脂溶性成分隐丹参酮对Chang肝脏细胞细胞色素P450酶（CYP450）CYP3A4、CYP2C9表达的影响,明确丹参主要成分对CYP450酶的作用,以阐明基于CYP450酶隐丹参酮与其他药物间相互作用的分子基础,为临床合理使用含隐丹参酮的丹参制剂提供依据。方法 采用CCK-8法考察隐丹参酮对Chang肝脏细胞活力的影响,以确定药物的给药剂量范围;通过Western bloting法考察隐丹参酮在给药后1、3和7 d对Chang肝脏细胞中CYP3A4和CYP2C9蛋白表达的影响;通过定量RT-PCR法考察隐丹参酮对Chang肝脏细胞中CYP3A4和CYP2C9 mRNA表达的影响。结果 给药1 d,隐丹参酮对CYP3A4蛋白及mRNA表达无显著影响。但随时间延长,给药3 d和7 d,隐丹参酮可抑制CYP3A4蛋白及mRNA的表达（P <0.05）。给药1、3和7 d,隐丹参酮对CYP2C9蛋白及mRNA的表达均无显著影响。结论 连续给予隐丹参酮可抑制CYP3A4 mRNA和蛋白的表达。提示临床在连续使用含隐丹参酮时,需要关注其与CYP3A4底物药物之间可能的相互作用。     

定点突变法确定人体CYP2A6 和 CYP2A13香豆素 代谢的关键氨基酸

  【目的】 通过比较人体主要尼古丁代谢酶CYP2A6和CYP2A13野生型及突变体酶蛋白对香豆素7-羥化反应的催化动力学特征,确定影响两者催化活性差异的关键氨基酸残基, 提供建立评估人群尼古丁代谢酶基因多态性与吸烟行为及癌症易感性生物标记的依据&#65377; 【方法】 运用定点突变和Sf9昆虫杆状病毒蛋白表达体系产生CYP2A6 和CYP2A13在300,301以及369位点氨基酸互换的突变体蛋白质,测定系列香豆素浓度下的各个酶蛋白对香豆素7-羥化的催化反应活性,获得动力学参数并与野生型酶蛋白进行比较分析&#65377; 【结果】 与野生型CYP2A6相比较,其Ile300 → Phe突变体催化效率(Kcat = Vmax / Km)显著下降而Gly301 → Ala 突变体催化效率显著上升(1.64 和8.02 相对于野生型3.56, P < 0.01)&#65377;与之相对应,CYP2A13 的Phe300 → Ile 突变体催化效率则明显上升而Ala301 → Gly 突变体催化效率显著下降(1.03 和0.06 相对于野生型的0.27, P < 0.05)&#65377;这些酶催化特性的改变,主要是由于Vmax 的改变所致&#65377;369位的氨基酸残基,无论是Ser还是Gly对CYP2A6或CYP2A13的香豆素7-羥化反应催化活性均无明显的影响&#65377; 【结论】 300 和301位的氨基酸是影响CYP2A6及CYP2A13对香豆素7-羥化反应催化活性的关键残基,而369位氨基酸不影响此活性&#65377;     

CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建CYP2 B6基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta2(DE3)pLysS]中高效表达重组蛋白。方法:以质粒为模板,用PCR技术扩增出CYP2 B6基因,并将其分别插入pET-22b( )、pET-28b( )和pET-32a( )质粒中,经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta2(DE3)pLysS,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果:经PCR、测序鉴定,构建了CYP2 B6基因表达质粒;采用考马斯亮蓝染色法检测重组蛋白表达,pET-22b( )-CYP2 B6未见目的蛋白表达;pET-28b( )-CYP2 B6有目的蛋白表达,约占蛋白总量的5%;而pET-32a( )-CYP2 B6可以高效地表达CYP2 B6,在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导3 h后,所表达的CYP2 B6蛋白约占细菌总蛋白的30%;质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为CYP2 B6。结论:成功地使CYP2 B6基因在原核系统中高效表达。