HBV阳性血清体外感染HepG-2细胞方法建立

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清体外感染人肝癌细胞系HepG-2的方法。方法低温同步化处理HepG-2细胞后用高浓度HBV阳性血清与含有4%聚乙二醇的无血清伊格尔极限必需培养基(MEM)共孵育HepG-2细胞,设阴性对照组和空白对照组;18 h后加入含10%胎牛血清的MEM继续培养6 d,每隔24 h收集细胞和培养上清,荧光定量PCR检测HBV DNA,间接免疫荧光技术检测细胞内乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。结果 HBV阳性血清感染组HepG-2细胞内和培养上清中在感染后第1 d可检测到HBV DNA,分别为(16.04±7.99)×10³、(8.84±3.97)×10³ copies/mL,细胞内DNA含量在第2 d达到(3.51±1.86)×10⁵ copies/mL,然后逐渐下降,在第4 d降到检测下限以下,而培养上清中病毒DNA在检测的时间内逐渐升高,在第6天达到(8.41±5.34)×10⁵ cop-ies/mL;间接免疫荧光检测感染组细胞膜和胞浆中均有HBsAg表达;传代培养感染细胞后,在第1代细胞培养上清和细胞内均可检测到HBV DNA(3.58×10⁵、7.34×10⁵ copies/mL),第2代培养上清中可检测到少量HBV DNA(2.89×10³ copies/mL),但细胞内检测到HBV DNA低于检测下限(896 copies/mL),第3代细胞的上清和细胞内均未检测到HBV DNA。结论 HBV阳性血清在一定条件下可以感染HepG-2细胞,病毒能在细胞内进行短期复制。     

HBV母婴传播胎盘细胞感染体外模型建立

目的 研究胎盘滋养层细胞系Bewo被乙型肝炎病毒(HBV)感染的可能性,为HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究建立合适的体外模型.方法 高浓度HBV DNA阳性血清与Bewo细胞共培养,荧光定量PCR法检测培养上清中HBV DNA含量;免疫组织化学技术检测细胞爬片Bewo细胞中HBsAg的表达.结果 HBV DNA阳性血清与Bewo共培养1 d后及时清洗细胞,更换培养液后1,2,3 d,细胞培养上清液中HBV DNA含量为4.67×10³,2.22×10⁴,3.63×10³;HBV DNA阳性血清与Bewo共培养2 d后及时清洗细胞,更换培养液后1,2,3 d,细胞培养上清液中HBV DNA含量为3.21×10⁴,3.99×10⁴,5.77×10⁴.免疫组织化学技术检测细胞爬片Bewo细胞中HBsAg呈阳性表达.HBV DNA阳性血清与Bewo共培养对细胞形态无明显影响.结论 胎盘滋养层细胞系Bewo与HBVDNA阳性血清共孵育可被HBV直接感染,该细胞系可用于进行胎盘HBV感染机制的研究.     

乙型肝炎病毒感染人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞体外培养模型的建立

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）感染人绒毛膜癌滋养层细胞（BeWo）体外培养模型,探讨HBV宫内感染机制。方法应用高病毒载量的HBV阳性血清感染BeWo细胞并传代,应用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术检测感染初代细胞和传代细胞内以及上清液中HBV DNA量;应用化学发光微粒子免疫法检测感染后初代细胞和传代细胞的上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)量;应用SABC免疫组化检测感染细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的表达。结果感染初代各时间点细胞内和上清液中HBV DNA量随时间延长而增加,120 h HBV DNA量最高;传代细胞内和上清液中HBV DNA量随传代次数增加逐渐降低,5代后检测均为阴性。感染初代各时间点细胞的上清液中HBsAg量随时间延长而增加;传代细胞的上清液中HBsAg量在1～3代为阳性,但量逐渐降低,4代后均为阴性。感染初代各时间点细胞和传代细胞的上清液中HBeAg量均为阴性;1～3代细胞HBsAg、HBcAg染色可见阳性细胞。结论HBV可以感染BeWo细胞,且能在传代细胞中表达;BeWo细胞可用于HBV宫内感染机制的研究。     

白介素4对乙型肝炎病毒体外复制和表达的影响

目的 探讨IL-4对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg及HBV DNA复制的抑制作用,认识Ⅱ-4在抗HBV感染中的作用.方法 通过MTT比色法检测不同浓度重组IL-4(rIL-4)对HepG2.2.15细胞的细胞毒性作用,用ELISA检测rIL-4对HepG2.2.15细胞不同时相HBsag和HBeAs分泌的作用,用实时荧光定量PCR检测rIL-4对HBV DNA合成的影响.结果 rIL-4的各浓度对HepG2.2.15细胞无细胞毒性作用;rIL-4处理HepG2.2.15细胞后,不同浓度组HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量在96 h的差异具有统计学意义(P＜0.05),但rIL-4的浓度低于100ng/mL的各组,HBsAg和HBV DNA含量在处理48 h时,各组间无明显差异(P＞0.05).此抑制作用随rIL-4浓度的增加而增强.结论 rIL-4在体外有直接的抗HBV作用.     

HBsAg阳性孕妇新生儿外周血单个核细胞乙型肝炎病毒感染状况及意义的研究

目的了解乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇新生儿外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒(HBV)感染状况及其在HBV宫内感染中的意义.方法用原位杂交(ISH)和原位PCR(IS PCR)法对HBsAg阳性孕妇新生儿PBMC进行HBV DNA检测.用随机引物法进行地高辛-HBVDNA探针的标记和定量.结果ISH及IS PCR检测PBMC HBV DNA,探针浓度以0.6μg/ml、蛋白酶K浓度以10μg/ml、IS PCR以20个循环数为佳.HBsAg阳性孕妇新生儿中,血清HBsAg、HBVDNA均阳性者有72.73%PBMC HBV DNA阳性;HBsAg阴性、HBV DNA阳性者中,有65.91%PBMC HBV DNA阳性;血清HBsAg、HBV DNA均阴性者中,仍有15.79%PBMC中HBV DNA阳性.结论IS PCR检测对低丰度PBMC HBV DNA具有细胞内定性和定位的特点.血清HBV DNA阳性新生儿多数可检出PBMC HBV DNA,而血清HBV DNA阴性新生儿也可呈PBMC HBV DNA阳性.提示PBMC HBV感染应作为HBV宫内感染的诊断指标之一.     

母血HBV DNA含量与新生儿HBV感染关系

目的 探讨HBsAg阳性孕妇外周血乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量及细胞转运与新生儿HBV感染的关系.方法 用荧光定量PCR方法定量检测HBsAg阳性孕妇血清HBV DNA;用等位基因特异性PCR及半巢式PCR技术扩增HBsAg阳性孕妇新生儿外周血中母亲DNA,通过检测谷胱甘肽-S-转移酶(GSTM1)、血管紧张素转换酶(ACE)等位基因确定母-胎细胞转运;用巢式PCR检测新生儿血清、外周血单个核细胞(PBMC)中HBV DNA.结果 随着孕妇血清HBV DNA含量的增加,新生儿HBV DNA阳性的危险性呈现增高趋势(X~2=13.16,P<0.05,趋势X~2=12.42,P<0.05),而孕妇血清HBV DNA含量与新生儿PBMC HBV DNA阳性无关(总X~2=2.41,P>0.05,趋势X~2=0.35,P>0.05);孕妇血清HBV DNA含量与母-胎细胞转运无关(总X~2=4.14,P>0.05,趋势X~2=0.001,P>0.05);母-胎细胞转运与新生儿外周血PBMC HBV DNA阳性有关(X~2=10.26,P<0.05),而与新生儿外周血HBV DNA阳性无关(X~2=0.49,P>0.05).结论 HBsAg阳性孕妇血清HBV DNA含量、母-胎细胞转运与新生儿HBV感染有关,分别是新生儿血清、PBMC HBV感染的重要危险因素.     

人胎肝干细胞体外感染乙型肝炎病毒模型的建立

目的 建立一种稳定的基于人胎肝干细胞的维持乙型肝炎病毒(HBV)复制和传代的体外细胞培养模型,为深入研究乙肝病毒的生命周期和发病机制提供必要的工具.方法 原代分离12～20周胎龄的胎肝干细胞,用乙肝病毒阳性血清感染胎肝干细胞;荧光定量PCR追踪检测细胞上清和细胞内乙肝病毒DNA及细胞内乙肝病毒复制中间体-闭合环状双链D...     

NAPP体外抗乙型肝炎病毒作用的实验研究

[目的]应用HepG2.2.15细胞株作为体外抗乙型肝炎病毒的实验模型,研究NAPP对乙肝病毒的抑制作用。[方法]以NAPP梯度浓度与HepG2.2.15细胞混合培养,通过MTT法检测药物的细胞毒性,9 d后取细胞培养上清液,用ELISA法测定HBsAg、HBeAg含量,荧光定量PCR检测上清液中病毒载量。[结果]NAPP浓度在1 mg/ml时,对细胞无明显毒性;NAPP在所稀释的各浓度下,对HBsAg、HBeAg均有抑制作用,对HBsAg、HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5;NAPP可抑制HBV-DNA的复制。[结论]NAPP体外对HBV有显著的抑制作用。     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞分泌IL-12功能的初步研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染状态下树突状细胞(DCs)的免疫功能。方法运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法,对12例慢性乙型肝炎血清HBV DNA阳性及10例血清HBV DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV DNA进行检测,并比较不同HBV滴度时DCs分泌白细胞介素(IL)-12的功能,同时收集肝炎病毒标志物阴性,肝功能正常的健康志愿者10例作对照。结果 12例血清HBV DNA阳性患者中有7例DCs内可检测到HBV DNA,检出率为58.33%。血清HBV DNA阳性组DCs培养上清IL-12水平明显低于血清HBV DNA阴性组及对照组(均P0.01);而IL-12的表达水平在DCs HBV DNA阳性组明显低于DCs HBV DNA阴性组及对照组(均P0.01)。结论慢性乙型肝炎患者外周血I)Cs亦能受到HBV的感染,感染了HBV的DCs,其IL-12分泌功能明显下降。     

荧光定量PCR检测289例乙型肝炎病毒DNA意义分析

目的荧光定量PCR检测血样中乙型肝炎病毒DNA拷贝数，探讨血清HBV—DNA检测结果与HBV抗原抗体(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)5项标志物(HBV—M)间的关系及临床意义。方法采用荧光定量PCR和ELISA法分别检测289例乙肝患者血样。结果122例HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性血样中，HBV—DNA阳性检出率98．4％；89例HBsAg、HBeAb、HBcAb均阳性血样中，HBV—DNA阳性检出率42．7％；27例HBsAg、HBcAb均阳性血样中，HBV—DNA阳性检出率29．6％；6例HBV—M全阴性血样中，1例HBV—DNA呈弱阳性。结论只有检测HBV—DNA才能确定HBV的真实感染和复制情况。荧光定量PCR检测HBV—DNA作为判断乙肝病毒感染、复制及传染性强、弱等的确定依据，在追踪患者预后及流行病学上有一定意义。