泛素连接酶β-TrCP降解BCR-ABL 融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的抑制*

目的:t（9;22）（q34;q11）突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML ）发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N 端寡聚化区域（Oligomerization domain,OD）特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP 的β-TrCP-OD-HA 的重组腺病毒载体,经泛素- 蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的影响。方法:HEK293 细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5 Δ F-TrCP-OD-HA 及空载Ad5GFP 重组腺病毒载体,感染K562 细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA 对K562 细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA 重组腺病毒载体的K562 细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4% 以上,β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 可在K562 细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562 细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA 组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562 细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S 期细胞数下降至10.88%±2.42% 、G0/G1 期升高至85.6%±5.61% ,与Ad5 β-TrCP-OD-HA 组、Ad5GFP 组及对照组相比,差异具有统计学意义（P 均<0.05）。 结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 能够在白血病K562 细胞中表达;β-TrCP-OD-HA 可以抑制K562 细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。      

ERK参与裸鼠体内辛伐他汀诱导K 562细胞凋亡的调控作用

目的：探讨辛伐他汀（simvastatin）作用于裸鼠体内K562细胞后Ras-MAPK信号转导通路胞外信号调节激酶（extracellular signal—regulated protein kinase，ERK）分子水平的变化，以说明ERK参与裸鼠体内辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的调控作用。方法：体外培养慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562细胞，构建BALB／c-nu／nu裸鼠的K562细胞移植瘤模型。流式细胞术（FCM）检测对照组和两个辛伐他汀处理组的K562细胞周期变化，TUNEL法检测K562细胞晚期凋亡情况。采用RT-PCR检测K562细胞中Ras-MAPK信号通路N-Ras、ERK1mRNA的差异表达。免疫组织化学标记葡聚糖聚合物（labbled dextran polymer，LDP）法检测P-ERK蛋白水平变化。结果：辛伐他汀能够明显抑制裸鼠K562移植瘤组织的增长，随着辛伐他汀剂量的增加，K562细胞移植瘤体积和质量明显减小（P〈0．05，P〈0．01）。每次注射0．05mg的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞发生明显的G0／G1期停滞，不同剂量的辛伐他汀能够诱导K562细胞发生明显的凋亡，并随剂量的增加，凋亡率逐渐增高（P〈0．01）；不同剂量的辛伐他汀能够引起N-Ras、ERK1mRNA的表达下调（P〈0．01）。与对照组相比，两个处理组的p-ERK蛋白分别出现表达下调（P=0．01，P〈0．01）。结论：辛伐他汀在体内可能依赖Ras—MAPK信号转导通路ERK基因和蛋白水平的表达下调诱导K562细胞凋亡发生。     

野生型p53基因蛋白在氨肽酶抑制剂诱导人白血病细胞株K562细胞凋亡的实验研究

目的研究野生型p53基因蛋白对国产氨肽酶抑制剂乌苯美司(ubenimex)诱导人白血病细胞凋亡的影响及其作用机制。方法真核转导试剂FuGEMNE^TM6转导入K562细胞，免疫组化法检测细胞p53蛋白的表达，DNA片段原位末端标记及流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡，Rhodamin(Rh)123染色后，FCM检测细胞线粒体跨膜电位。结果p53基因cDNA转导的细胞p53蛋白表达增加；p53基因转导能促进ubenimex诱导K562细胞凋亡并增加ubenimex诱导的K562细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的下降。结论野生型p53基因转导能促进ubenimex诱导K562细胞凋亡，并可能参与线粒体信号传导通路的调控。     

共表达p53、p16基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

[目的]构建p53、p16基因真核表达载体,观察其在K562细胞中的表达。[方法]设计并构建包含野生型p53cDNA、p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4．1-53—16,脂质体法转染K562白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot等方法鉴定外源性p53及p16的表达情况。[结果]构建成功p53、p16基因双表达真核载体,体外成功转染入K562细胞,检测到K562细胞外源性p53、p16蛋白的表达。[结论]重组质粒pBudCE4．1-53-16体外转染K562细胞后．目的基因能够在细胞中同时表达,为进一步研究两种基因用于肿瘤治疗奠定基础。     

腺病毒介导HSV—tk自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk)基因联合人野生型p53基因共转染,对直肠癌细胞杀伤作用。方法 构建重组腺病毒质粒pAdCMV-Link1(tk/p53)、pAdCMV-Link(tik),pAdCMV-Link(p53),分别感染p53炎变的人直肠癌细胞SW837。进行细胞集落形成实验、细胞存活率的测定和裸鼠移植瘤治疗实验,观察HSV－tk/GCV系统与野生p53基因联合对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 应用pAdCMV-Link1(tk/p53),pAdCMV-Link(-),pAdCMV-Link(tk),pAdCMV-Link(p53)重组腺病毒感染SW837细胞,加入GCV,各组细胞集落数分别为8、95、40、70。pAdCMV-Link(CD/53)组肿瘤细胞集落形成减少、细胞存活率显著下降（P＜0．01）。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为76．5％、0．8％、55．8％、23．2％,pACMV-Link(tk/p53)重组腺病毒对肿瘤的抑制作用最强。结论 HSV－tk自杀基因与野生型p53基因共转染,对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

慢病毒载体介导SHIP基因抑制K562细胞增殖及对P13K／Akt信号通路的调控

背景与目的：SHIP基因主要表达于造血细胞,通过降解PIP3抑制P13K／Akt信号通路而在造血细胞增殖和存活中起重要负调控作用。本研究通过慢病毒载体介导SHIP基因转染K562细胞,探讨SHIP基因改变及功能丢失与白血病发病的关系。方法：将携带SHIP基因的慢病毒感染K562细胞．FQ—PCR法检测SHIP转录水平,Western blot法检测转染后SHIP蛋白表达及Akt磷酸化水平的变化;比较SHIP基因表达前后细胞增殖、形态的变化。结果：K562细胞中SHIP蛋白阴性。以携带SHIP基因的慢病毒载体转染K562细胞后．细胞增殖抑制率升高,K562-wtSHIP—FIV—G细胞的增殖抑制率由转染第3天的（9．9±1．5）％升到第5天的（40．6±2．3）％;伴有Akt磷酸化水平明显减弱;转染后,K562．wtSHIP—FIV—G组细胞p-Akt的表达水平由0．533降低到0．245（P〈0．01）,细胞增殖明显被抑制。此外,SHIP蛋白还能使K562细胞出现凋亡特征,Hoechst33342染色结果转染wtSHIP基因组K562细胞第5天早期凋亡率[（38．3±4．3）％]明显高于K562-FIV—G组细胞[（8．2±0．9）％]和未转染组K562细胞[（7．7±0．8）％]。结论：SHIP基因具有重要的抑制细胞增殖和促进凋亡的能力,SHIP基因缺失导致K562细胞P13K／Akt信号途径失调,促进K562细胞增殖。     

E1B55kDa缺陷型腺病毒对人肝癌细胞的杀伤研究

目的 探讨E1B55kDa缺陷型腺病毒dl1520对肝癌细胞的体内外杀伤作用。方法 用dl1520分别感染p53基因型不同的人肝癌细胞,感染后第4天用染色的方法检测存活细胞。用RT－PCR检测细胞内p53和p21^Waf-1基因表达的改变,通过检测腺病毒衣壳蛋白hexon基因的表达证实腺病毒的感染。在SCID裸鼠瘤体内注射dl1520,观察dl1520对肝癌细胞的体内杀伤作用。结果 p53基因缺失的肝癌细胞Hep3B对dl1520诱导的细胞毒性作用最敏感,超过60％的细菌被杀伤,而不足20％的PLC／PRF／5（p53基因突变型）和HepG2(p53基因野生型）肝癌细胞被杀伤。腺病毒感染后,HepG2细胞内p53和p21^Waf-1基因表达水平均明显升高。瘤体内注射dl1520,可显著抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生长,而对PLC／PRF／5和HepG2的裸鼠移植瘤则无明显的生长抑制作用。结论 E1B55kDa缺失的腺病毒可以选择性地杀伤p53基因缺失的肝癌细胞,是一种潜在的肿瘤治疗手段。     

p53基因对胶质瘤细胞系U251生长抑制作用的研究

背景与目的：肿瘤抑制基因p53是调节多种与细胞周期、凋亡、DNA修复等有关基因表达的转录因子。p53基因在大约30％的胶质瘤中发生突变，在胶质瘤的发生和发展中起重要作用。本文主要探讨野生型p53基因过表达对脑胶质瘤细胞系U251细胞生长抑制的机制。方法：通过p53腺病毒表达载体pAdCMV-p53及空载体pAdCMV-lacZ分别感染U251细胞系，RT-PCR及Westem blot方法检测转染效率；并通过MTT检测生长抑制率、流式细胞仪检测细胞周期及TUNEL检测分析细胞凋亡等指标观察p53基因对U251细胞生长的影响。结果：MOI为100时，野生型p53基因的过表达可引起U251细胞G0、G1期阻滞、诱导U251细胞凋亡以及引起U251细胞生长抑制。结论：p53基因可以通过细胞周期G0、G1期阻滞及诱导细胞凋亡抑制胶质瘤细胞系U251的生长。     

抑癌基因p16INK4a与p53抑制白血病细胞株生长作用的比较

目的比较野生型p16INK4a、p53抑癌基因的表达对白血病细胞株K562和HL60的生长抑制。方法采用脂质体介导野生型p16INK4a、p53抑癌基因转染K562、HL60细胞并进行G418筛选,免疫印渍检测p16INK4a、p53基因的表达,通过细胞生长曲线检测细胞活力,流式细胞仪进行细胞DNA周期分析及细胞凋亡分析,采用联苯胺氧化试验检测K562细胞的分化。结果转染后p53、p16INK4a在K562及HL60细胞中表达;与对照细胞相比,实验组细胞生长受到明显的抑制,G1期细胞数增加,S期细胞减少。与p16INK4a相比,抑癌基因p53使细胞表达Annexin V增加,显示出更强的致凋亡现象,尤其在HL60细胞株。结论抑癌基因p16INK4a、p53能有效抑制白血病细胞株的生长,可能更适合复发、难治性白血病的基因治疗。     

腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

为研究野生型p53基因对肺腺癌细胞株GLC-82细胞生长的作用,确立腺病毒介导的野生型p53基因在肿瘤治疗中的意义,应用分子克隆技术首先构建了野生型p53复制缺陷型腺病毒重组体,应用生化染色方法确定了重组体的转染效率,以免疫组化法及PCR技术分别确定了腺病毒载体介导的p53基因转染GLC-82细胞后p53蛋白和p53 cDNA的表达情况;最后应用细胞生物学方法检测了p53对GLC-82细胞扩增及细胞周期的影响.结果表明所构建的重组体可以高效、快速转染GLC82细胞,抑制GLC-82细胞扩增,使细胞合成期和分裂后期的量减少,出现细胞凋亡现象:提示野生型p53基因导入可作为治疗肺腺癌的途径之一     

葛根总黄酮诱导白血病细胞株凋亡及其分子机制的研究

 目的　探讨葛根总黄酮（PR）对慢性粒细胞白血病（CML）细胞株K562和急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞增殖及凋亡的影响。方法　采用MTT法检测PR对K562细胞、NB4细胞的增殖抑制率;光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态改变;Hoechest33258荧光染色AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡率;DNA PI染色法分析细胞周期及亚二倍体峰。Western blot分别检测NB4细胞JNK、PARP、bcl-2、Caspase3,K562细胞bcr-abl、p53、bcl-2、Fas／FasL蛋白表达的变化。结果　12.5～200 μg／ml PR均能抑制K562、NB4细胞增殖。光学显微镜及荧光显微镜下观察到核固缩、凋亡小体等典型的细胞凋亡改变;Annexin V+／PI-细胞呈时间-剂量依赖性增加;DNA PI染色法发现细胞亚二倍体比例增加,G1期比例下降、S期比例增加。PR呈时间-剂量依赖性抑制K562细胞、NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡。不同浓度PR干预后K562细胞bcr-abl蛋白水平呈浓度依赖性下调（F＝18.74,P＜0.05）,而bcl-2则无明显变化;p53 表达呈浓度依赖性上调;Fas／FasL 表达无明显变化。NB4细胞JNK、PARP及Caspase 3蛋白表达与PR浓度呈正相关,与凋亡抑制蛋白bcl-2则呈负相关（F＝42.32,P＜0.05）。结论　PR能有效抑制K562、NB4细胞增殖,阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡,但分子机制不同。提示一定浓度PR具有较广谱的抗白血病效应。     

Adenovirus-mediated p16INK4a gene expression radiosensitizes non-small cell lung cancer cells in a p53-dependent manner

We examined the influence of adenovirus-mediated wild-type p16INK4a (Ad/p16) expression on the radiation sensitivity of NSCLC cell lines, all of which lacked constitutive p16INK4a but each of which varied in p53 status: A549 (-p16INK4a/ +pRb/wt-p53), H322 (-p16INK4a/ +pRb/mt-p53), and H1299 (-p16INK4a/ +pRb/deleted-p53). The in vitro clonogenic survival results indicate that Ad/p16 enhanced the radiosensitivity of A549 but not H322 or H1299. Further analysis indicated that the apoptosis induced by combination therapy using Ad/p16 plus irradiation was dependent on the endogenous p53 status of the cancer cells. We performed Western blotting to analyse the p53 protein expression of A549 cells treated with either Ad/p16 or Ad/Luc. Endogenous p53 protein levels were higher in A549 cells transfected with Ad/p16 than in those transfected with Ad/Luc. Furthermore, when wt-p53 protein expression was restored in H1299 using Ad/ p53, Ad/p16 stabilized p53 protein expression and radiosensitized the cells. These results suggest that Ad/ p16-induced stabilization of p53 protein may play an important role in Ad/p16 mediated radiosensitization by enhancing or restoring apoptosis properties. Thus, Ad/ p16 plus radiation in combination may be a useful gene therapy strategy for tumors that have wt-p53 but nonfunctional p16INK4a.     

干扰Wrap53基因调控人骨肉瘤U20S细胞放射敏感性实验研究

目的：探讨干扰Wrap53基因表达对肿瘤细胞放射敏感性的作用及其分子机制。方法：构建针对Wrap53的干扰质粒;脂质体转染法转染至p53野生型（wtp53）的人骨肉瘤U20S细胞;RT-PCR和蛋白质印迹法检测Wrap53和wtp53基因的mRNA和蛋白表达;克隆形成实验测定放射敏感性参数;流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析细胞周期变化。结果：Wrap53的特异性shRNA质粒转染U20S细胞后,细胞内Wrap53和wtp53的mRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制;Wrap53基因干扰组U20S细胞的D0值为0．44±0．01,明显高于阴性对照组0．37±0．01,P=0．001,Wrap53基因干扰组SF2值为0．72士0．10,高于阴性对照组0．44±0．02,P=0．047;Wrap53干扰细胞在放射后16h（P=0．014）和24h（P=0．011）的Gz／M期阻滞更加明显,显著高于对照组;但Wrap53干扰细胞在放射后出现G,期阻滞减少,以放射后24h最为显著,P=0．001。结论：干扰Wrap53基因表达降低了U20S细胞的放射线敏感性,该作用可能与下调wtp53表达和诱导细胞放射后G2／M期阻滞有关。     

腺病毒介导野生型p53基因对人白血病细胞系HL-60、K_(562)生长的抑制作用

目的探索肿瘤抑制基因ｐ５３对人白血病细胞系的生长抑制作用和促凋亡作用。方法选用含野生型ｐ５３基因的重组腺病毒载体,体外感染人白血病细胞系ＨＬ－６０、Ｋ５６２。通过细胞生长曲线,ＤＮＡ检测及流式细胞仪分析检测转染细胞的增殖受抑制和细胞凋亡的发生。结果ＰＣＲ检测转染后ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞ｐ５３ｃＤＮＡ表达。转染后Ａｄ／ｐ５３病毒对ＨＬ－６０细胞和Ｋ５６２细胞的生长有抑制作用。随着Ａｄ／ｐ５３病毒浓度加大,ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞的ＯＤ值越低即生长抑制程度越大。经Ａｄ／ｐ５３病毒转染的ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞均有明显的细胞凋亡峰出现,对照细胞则无。细胞周期分析无明显异常发现。结论重组腺病毒载体介导的野生型ｐ５３基因在体外对人白血病细胞系ＨＬ－６０和Ｋ５６２的生长有抑制作用,能导致细胞凋亡的发生。     

Wt-p53 action in human leukaemia cell lines corresponding to different stages of differentiation.

Recent studies support the potential application of the wt-p53 gene in cancer therapy. Expression of exogenous wt-p53 suppresses a variety of leukaemia phenotypes by acting on cell survival, proliferation and/or differentiation. As for tumour gene therapy, the final fate of the neoplastic cells is one of the most relevant points. We examined the effects of exogenous wt-p53 gene expression in several leukaemia cell lines to identify p53-responsive leukaemia. The temperature-sensitive p53Val135 mutant or the human wt-p53 cDNA was transduced in leukaemia cell lines representative of different acute leukaemia FAB subtypes, including M1 (KG1), M2 (HL-60), M3 (NB4), M5 (U937) and M6 (HEL 92.1.7), as well as blast crisis of chronic myelogenous leukaemia (BC-CML: K562, BV173) showing diverse differentiation features. By morphological, molecular and biochemical analyses, we have shown that exogenous wt-p53 gene expression induces apoptosis only in cells corresponding to M1, M2 and M3 of the FAB classification and in BC-CML showing morphological and cytochemical features of undifferentiated blast cells. In contrast, it promotes differentiation in the others. Interestingly, cell responsiveness was independent of the vector used and the status of the endogenous p53 gene.     

Axin通过激活p53的表达抑制结肠癌细胞的生长

目的： 观察过表达Axin对结肠癌SW480细胞生长的影响,并探讨其作用机制。方法：将pCMV5-HA-Axin质粒瞬时转染至结肠癌SW480细胞中,并设置转染空载体pCMV5-HA及未转染空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)比色法及克隆形成实验检测细胞增殖状态的变化,流式细胞仪检测细胞周期变化;RT-PCR检测Axin及p53 mRNA的表达;Western blot检测Axin及P53蛋白的表达。结果：与转染空载体及空白对照组比较,过表达Axin显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖。MTT实验显示转染Axin后细胞生长明显受到抑制,存活的瘤细胞明显减少(P<0.05);克隆形成实验结果显示瞬时转染Axin质粒组细胞集落形成能力明显下降(P<0.05);流式细胞仪分析检测结果显示转染Axin质粒后结肠癌SW480细胞周期G1前期比例升高,G1期明显被阻滞,S期比例下降(P均<0.05)。RT-PCR结果显示转染Axin的SW480细胞中p53 mRNA的表达较转染空载体组升高约1倍(P＜0.05);同时,Western blot结果显示转染质粒Axin后结肠癌SW480细胞中P53的蛋白表达量明显增加,较转染空载体组几近升高1倍(P＜0.05)。结论：过表达Axin抑制结肠癌SW480细胞增殖,其作用机制是通过激活癌基因p53的表达而发挥效应的。     

增强子结合蛋白C/EBPα对白血病BALB/c裸鼠的肿瘤抑制作用

  目的　探讨增强子结合蛋白C／EBPα在白血病裸鼠体内的肿瘤抑制作用。方法　将30只BALB／c裸鼠随机分转染组（10只）、空载组（10只）、对照组（10只）,建立皮下瘤模型,并将30只BALB／c裸鼠如上分组建立白血病模型,将C／EBPα稳定表达细胞株pEGFP-C／EBPα-K562、空载细胞株pEGFP-K562及白血病细胞株K562分别经皮下和尾静脉注射到相应组裸鼠体内,形成皮下瘤和血液病模型。观测皮下肿瘤的变化,应用TUNEL检测细胞的凋亡,瑞特-吉姆萨染色观察血液病模型裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞增殖能力,RT-PCR检测增殖相关基因的表达。结果　皮下瘤模型中pEGFP-C／EBPα-K562组肿瘤质量及最大直径为（2.4±0.1）g和（11±2）mm,空载组和对照组分别为（5.1±0.3）g、（19±3）mm和（5.7±0.4）g、（23±3）mm（均P＜0.05）,TUNEL检测发现pEGFP-C／EBPα-K562组肿瘤细胞凋亡明显增加（P＜0.05）;血液病模型鼠外周血可见白血病细胞,pEGFP-C／EBPα-K562组白血病细胞增殖能力明显低于空载组和对照组,可见明显细胞分化现象,RT-PCR检测发现p53基因上调和c-myc基因下调。结论　增强子结合蛋白C／EBPα在白血病小鼠体内具有促进肿瘤细胞凋亡和抑制白血病细胞增殖的能力,并能促进白血病细胞分化。C／EBPα的白血病抑制作用可能是通过对相应基因的调控来实现。