单克隆永生化人骨髓基质干细胞分化能力和VEGF分泌量的相关性

目的 观测单克隆人永牛化骨髓基质干细胞(hMSC-TERT)体内外分化潜能和自分泌血管内皮细胞牛长因子(VEGF)的相关性.方法 梯度稀释法建立单克隆hMSC-TERT,ELISA方法测定细胞培养液中VEGF含量.将各单克隆细胞进行脂肪、骨和神经样细胞体外诱导,检测多向分化能力.接种联合免疫缺陷性鼠(SCID),免疫组化法检测细胞体内分化率.将各单克隆细胞上清液中VEGF的含量变化值与其上皮细胞分化率进行单变量方差分析.结果 各hMSC-TERT细胞的体内、外分化能力存在筹异.细胞上清液中,第5天VEGF浓度较第3天明显减少.各细胞上清液中VEGF浓度的减少幅度差异有统计学意义(hMSC-TERT2,22 ±0.33;hMSC-TERT20,7.68±0.25;hMSC-TERT-C2,103±35.67;hMSC-TERT-C3,140±34.17;hMSC-TERT-C6,115±28.75;hMSC-TERT-C13,-21±11;hMSC-TERT-C19,181±52.92;hMSC-TERT-C20,101±27.08;hMSC-TERT-C21,-29±10.5;hMSC-TERT-C29,46±25.42),减少幅度与细胞体内分化时角蛋白的阳性率呈正相关.结论 单克隆hMSC-TERT上清液中VEGF变化幅度与细胞体上皮分化能力呈正相关.为选用特定的单克隆hMSC-TERT细胞进行临床和实验研究做了有益的探讨.

Abstract：

Objective To investigate the multi-differentiation potential and VEGF secretory volume of monoclonal immortalized human mesenchymal stem cells(hMSC-TERT)and to determine the relationship between them.Methods Monoelonal hMSC-TERT were isolated using limiting dilution.The growth curves of them were detected by method of MTT.ELISA was used to detect the concentration of VEGF in the supernatant of those mnoclonal hMSC-TERT.Their adipocytic,osteogenic,neuronal differentiation potential in vitro were determined by Oil Red O staining,Van Kossa staining and immuocytochemistry for Tubulin-βⅢ antibody.Those Monoclonal hMSC-TERT were transplanted into the subcutaneously of severe combined immunodeficiency(SCID) mices.The grafts of those cells were removed and analyzed by immunohistochemistry for pathologic tissue markers to discover the multi-differentiation potential of those mnoclonal hMSC-TERT in vivo.Results There was statistically significant difieFence between different mnoelonal hMSC-TERT in multidifferentiation potential and the decreased concentration of VEGF in the supernatant of those mnoconal hMSC-TERT from the 3 rd day to the 5th day.The positive rates of CK in grafts formed by those monoelonal hMSC-TERT in SCID mices were direct correlation with the decreased concentration of VEGF in the supernatant of those cells.Conclusion The secretory capability of VEGF of those monoclonal hMSC-TERT may direct correlation with the epithelial differentiation potential of those cells.     

人膀胱癌细胞系BC-6的建立及其生物学特性

目的:建立人膀胱癌细胞系BC-6,为膀胱癌的基础研究提供实验模型.方法:18例膀胱癌标本采用组织块直接培养法、8例采用细胞悬液培养法行原代培养;其中12例同时行裸鼠皮下移植,在皮下生长后,连续裸鼠体内传代3次,再行体外培养.结果:组织块直接培养和细胞悬液培养均未成功.12例裸鼠皮下接种肿瘤有3例生长,l例裸鼠意外死亡,l例裸鼠体内传代F2代肿瘤消失.1例肿瘤裸鼠皮下接种后生长较快,裸鼠体内传代3次后,取部分肿瘤组织体外培养得到膀胱癌细胞系BC-6,其形态结构,分化程度与原发瘤保持一致,染色体形态仍为人类核型,众数维持在66～72之间,占82%,细胞周期分析G1期0.58,G2期0.08,S1期0.35,细胞群体培增时间为44h.结论:通过裸鼠体内移植瘤建立的膀胱癌细胞系BC-6,与原发癌保持相同的生物学特性,体外连续传代1 a以上,传代92代.细胞形态不变,生长周期恒定,己经成为一个稳定的细胞系.     

骨髓基质干细胞的单克隆培养和分化的实验研究

目的:通过对骨髓基质干细胞(MSCs)的单克隆化培养、鉴定和扩增,获得从一个单细胞克隆扩增出的大量均质的MSCs,并通过对这种MSCs诱导分化的实验研究,进一步确定这种单克隆来源的MSCs的分化和"横向分化能力".方法:无菌条件下获取大鼠的骨髓细胞,将获得的细胞经过充分打匀和滤过后制成单细胞悬液,然后以低密度,1×103个细胞数接种于培养板中,待细胞出现单细胞生长的克隆后,通过显微操作挑出相应的单细胞克隆.将挑出的单细胞克隆与相应的饲养细胞混合培养,快速进行扩增,扩增后的细胞进行细胞表面标志的鉴定,并进一步进行增殖和细胞分化实验.结果:在含有特定饲养层细胞的培养条件下,单克隆来源的MSCs能在抑制分化的状态下进行大量扩增,并保持细胞的均质性;而且在这种培养条件下,MSCs的增殖能力明显的高于常规培养条件;同时,获得的这种均质MSCs能成功的被诱导向软骨,神经样细胞分化.结论:通过骨髓细胞的单克隆培养,获得了均质和具有多向分化潜能的MSCs,这也为进一步更精确的研究MSCs的生物学特性提供了基础.     

具有肝转移倾向的结肠癌细胞亚系的筛选与鉴定

目的 筛选人结肠癌SW480细胞中具有特定肝脏转移倾向的亚克隆,比较它与母系生物学特性的差异,为结肠癌肝转移机制的研究提供基本的实验材料.方法 采用外科原位接种、组织块细胞培养法从裸鼠体内获得SW480细胞系中具有肝脏转移倾向的亚克隆SW480/M5;体内体外实验验证它与母系细胞在生物学特性上的差异.结果 体内实验证明SW480具有广泛转移的潜能,而SW480/M5细胞只具有向肝脏转移的潜能;SW480/M5细胞原位瘤的质量较SW480细胞大且皮下瘤生长速度较快:体外实验证明SW480/M5细胞的克隆形成能力,体外增殖能力、体外运动及侵袭能力较SW480细胞强,而对FN的粘附能力较SW480细胞弱.结论 从结肠癌细胞系SW480中筛选出的细胞亚系SW480/M5转移方向明确,是结肠癌肝转移机制研究的理想细胞模型.     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

大鼠卵黄囊的分化及其肿瘤性转化研究

目的研究12d大鼠胚胎脏层卵黄囊(VYS)向多胚层组织分化的潜能和在逆转录病毒感染下的肿瘤性转化特征。方法在不同培养条件、移植位点的条件下,观察VYS体内外分化的改变;另外利用逆转录病毒载体将荧光蛋白基因(GFP)转染12d卵黄囊细胞,对GFP标记的转化细胞进行体内外研究。结果在不同培养条件下,均对体外培养的或体内移植的大鼠卵黄囊向三个胚层分化的进程无特异的导向性。将荧光蛋白标记卵黄囊克隆细胞接种在裸鼠皮下长出了未分化的间质细胞肉瘤。结论12d大鼠胚胎脏层卵黄囊具有向三胚层分化的潜能;逆转录病毒感染导致卵黄囊间质细胞发生肿瘤性转化。     

克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性的研究

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选择有利于其生长的血清,低密度培养,传70%～80%生长汇合时传代保种.RT-PCR检测其Oct-4、SDF1、CD49a、CK19、c-met基因的表达;流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD90、HLA-1和HLADR;体外向骨、软骨、脂肪细胞方向诱导分化鉴定其分化潜能.结果:建立了人骨髓间充质干细胞系并在体外实现了克隆化扩增,该细胞系在体外连续培养达60个细胞倍增时间仍保持多向分化的潜能.细胞不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR,但表达Oct-4、SDF-1、CD49a、CK19、c-met、CD44、CD29、CD90、HLA-1.体外能诱导出骨、软骨、脂肪细胞.结论:得到了一个可稳定传代的克隆化扩增的人骨髓间充质干细胞系,该细胞系在体外可以分化为骨、软骨、脂肪细胞,并表达Oct-4、CK19和c-met.     

人子宫颈癌细胞系HCC—94的建立及其生物学特性

为建立子宫颈癌的体外培养细胞系，以人子宫颈高分化吕裸鼠移植瘤为材料进行体外培养，原代培养生长后行传代培养，并按照细胞系建立标准检测细胞的一系列生物不特性，并行克隆，无血清培养及对铂类抗癌药物的敏感性试验。     

克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性研究

目的 建立克隆化兔骨髓基质干细胞（MSC）系，并对其生物学特性进行研究，为组织缺损修复寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法 应用密度梯度离心和贴壁分离培养方法，从兔骨髓中获得原代骨髓MSCs，再应用克隆化分离培养技术，建立克隆化扩增的骨髓MSC系。体外传代培养、低温冻存复苏、形态学观察、生长曲线测定、染色体分析和分化潜能鉴定。结果 建立了一株克隆化兔骨髓MSC系。该细胞系在含10％胎牛血清的LG-DMEM中连续传代至第32代，仍保持旺盛的增殖能力，P4和P32代细胞染色体众数保持稳定的二倍体核型，成骨细胞诱导试验阳性。结论 获得一株具有旺盛的增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的克隆化兔骨髓MSC系。     

大鼠食管癌前上皮细胞(RE_(46))体外培养的生物学特性

在用体内-体外结合的方法建起了一株食管癌前恶性转化细胞系RE_(26-3)的基础上,用同样的方法建立了另一株不具备恶性转化的癌前细胞系RE_(46).提示两者病理形态上均为不典型增生,通过体外培养RE(46)细胞生物学上只有癌前细胞的特性不具恶性转化潜能,不能继续传代,而RE_(26-3)逐步显示各种恶性转化细胞的生物学特征,建成癌细胞系.     

SV40T基因介导的永生化对细胞生物学特性的影响

目的研究SV40 T基因对其诱导的永生化细胞系细胞表型的影响。方法以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料,进行体外培养。将永生化基因———SV40 T抗原基因转染第10代细胞,经筛选,抗性克隆扩大培养,得到永生化细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等,研究转染与未转染细胞的生物学特性,通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)在相同条件下检测转染与未转染细胞对顺铂、阿霉素、足叶乙甙、拓扑替康四种化疗药物的敏感性。结果建立人卵巢肉瘤样癌细胞系,命名为BUPH:OVSC-1。经SV40 T抗原基因转染,建立人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系,命名为BUPH:OVSC-2,两者均已长期稳定传代。通过比较,两者的生物学特性无明显差别,对不同化疗药物的敏感性无明显差别。结论SV40 T基因永生化的细胞保留了原细胞的分化表型,SV40介导的永生化细胞系可作为体外研究的模型。     

Derivation and characterization of Chinese human embryonic stem cell line with high potential to differentiate into pancreatic and hepatic cells

Background  Human embryonic stem cells have prospective uses in regenerative medicine and drug screening. Every human embryonic stem cell line has its own genetic background, which determines its specific ability for differentiation as well as susceptibility to drugs. It is necessary to compile many human embryonic stem cell lines with various backgrounds for future clinical use, especially in China due to its large population. This study contributes to isolating new Chinese human embryonic stem cell lines with clarified directly differentiation ability.

Methods  Donated embryos that exceeded clinical use in our in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) center were collected to establish human embryonic stem cells lines with informed consent. The classic growth factors of basic fibroblast growth factor (bFGF) and recombinant human leukaemia inhibitory factor (hLIF) for culturing embryonic stem cells were used to capture the stem cells from the plated embryos. Mechanical and enzymetic methods were used to propogate the newly established human embryonic stem cells line. The new cell line was checked for pluripotent characteristics with detecting the expression of stemness genes and observing spontaneous differentiation both in vitro and in vivo. Finally similar step-wise protocols from definitive endoderm to target specific cells were used to check the cell line’s ability to directly differentiate into pancreatic and hepatic cells.

Results  We generated a new Chinese human embryonic stem cells line, CH1. This cell line showed the same characteristics as other reported Chinese human embryonic stem cells lines: normal morphology, karyotype and pluripotency in vitro and in vivo. The CH1 cells could be directly differentiated towards pancreatic and hepatic cells with equal efficiency compared to the H1 cell line.

Conclusions  This newly established Chinese cell line, CH1, which is pluripotent and has high potential to differentiate into pancreatic and hepatic cells, will provide a useful tool for embryo development research, along with clinical treatments for diabetes and some hepatic diseases.

     

人胃癌细胞系的建立及其评价

目的 利用已建立的胃癌人源化异种移植瘤(Patient-derived xenograft,PDX)模型建立胃癌细胞系,并对建立的胃癌细胞系进行生物学特性评价.方法 选择12例生长状态良好的胃癌PDX模型,待小鼠移植瘤体积生长至500～900mm3时,取出肿瘤组织进行癌细胞的原代培养建立细胞系,通过细胞形态学观察、染色体分析、短片段重复序列(STR)分析、免疫组织化学染色、体外药敏及体内成瘤实验对其生物学特性进行分析鉴定,并在此基础上利用建立成功的胃癌细胞系进行化疗药物药效学评价.结果 12例PDX模型中共成功建立6例胃癌细胞系,细胞系可稳定多次传代.选择其中2例胃癌细胞系(GAXC031和GAXC066)进行生物学特性鉴定.遗传学结果证实,这2例细胞系来自亲本PDX模型,符合恶性胃癌的遗传学特征,在裸小鼠体内具有致瘤性.由细胞系建立的移植瘤模型在保留主要临床生物学特征的前提下,具有成瘤率高,潜伏期短,生长均一性好等特点.体外和体内药敏实验结果均表明,GAXC031对5-氟尿嘧啶有一定的敏感性[体外半抑制浓度(IC50)为0.265μmol/L,体内肿瘤生长抑制率(TGI)为30％～50％],而GAXC066不敏感(体外IC50为＞200 μmol/L,体内TGI＜0);2例细胞系对顺铂的敏感性均较强(TGI＞60％).结论 成功建立了6例人源胃癌细胞系.对GAXC031和GAXC066细胞系全面的分析和鉴定显示,细胞系与亲本PDX模型高度相关.细胞系体内外药敏实验结果显示,对同一个化疗药物,其体内与体外数据间存在很高的一致性.这些细胞系及相关模型可用于抗癌药物的研发和肿瘤基础研究.     

几种抗癌药对HL—60细胞在小鼠肾囊膜下生长的抑制作用

以纤维蛋白凝块为HL-60细胞支持物,将其接种于正常和免疫抑制小鼠肾囊膜下,观察其增殖特性和生长特点。结果HL-60细胞纤维蛋白凝块在免疫排斥反应出现前的正常小鼠肾囊膜下,体积增殖5倍左右;在免疫抑制小鼠肾囊膜下,增殖15倍左右。组织切片发现,在肾囊膜下生长6d细胞密度明显增加,生长细胞沿肾囊膜向四周侵润,肿瘤细胞切面面积明显扩大,且生长细胞仍保持HL-60细胞的形态特点。维甲酸(RA)、维胺酸(RⅡ)及三尖杉酯碱等药物可明显抑制HL-60细胞的生长。     

塞来昔布对人肝癌细胞增殖的抑制作用

目的 观察塞来昔布对肝癌增殖的抑制作用.方法 以人肝癌细胞株SMMC-7721为研究对象,四唑氮蓝还原法(MTT)观察不同浓度和作用时间的塞来昔布对细胞增殖的抑制作用,流式细胞技术检测细胞周期,并用小鼠肝癌细胞株H22建立昆明鼠移植瘤模型,观察塞来昔布对移植瘤生长的抑制效果.结果 MTT显示塞来昔布对人肝癌细胞SMMC-7721生长有显著的抑制作用,且呈现出时间和剂量依赖性;塞来昔布(40 μmol/L)作用于SMMC-7721细胞36h后,G1期细胞比率由44.7%上升至49.9%,S G2/M期细胞比率由55.4%下降至50.1%,细胞增殖受抑制.在体动物实验表明,塞来昔布对移植瘤的生长和局部转移有显著的抑制效果.结论 环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对不同来源的肝癌细胞株均有增殖抑制作用,可能是预防和治疗肝癌的重要候选药物之一.     

兔膀胱移行上皮细胞构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索以膀胱移行上皮细胞为种子细胞构建组织工程尿道的可行性。方法 取兔膀胱移行上皮细胞，体外培养传代后作为种子细胞与自制胶原膜体外联合培养并行裸鼠体内移植，通过对复合物扫描电镜、HE染色及角蛋白免疫组化检测，了解细胞在材料上的生长情况。结果 2h后移行上皮细胞在胶原膜上贴附生长，复合物移植体内20d后，移行上皮细胞分化成层，层厚1～5层。结论 该方法获取的膀胱移行上皮细胞是构建组织工程尿道的良好种子细胞，与胶原膜构建的复合物在体内形成了尿道类似物，有望成为替代尿道的组织工程材料。     

Establishment and characterization of cell sublines with high and low metastatic potential derived from human osteosarcoma

The most frequent cause of death of patients with osteosarcoma is the metastasis of tumour cells. In spite of successful control of the primary tumour, the mortality of the patients due to metastatic spread is more than 30% within 5 years. Recent studies about osteosarcoma metastatic mechanism are based on osteosarcoma matrilineal cell lines. For further studies of metastatic mechanism of osteosarcoma the establishment of a better metastatic experimental model of osteosarcoma is needed.     

大肠癌HT-29细胞亚系与母系转移能力和相关因子的比较

目的：探讨大肠癌细胞转移能力与肿瘤相关因素的关系。方法：用结肠癌HT－29亚系HT－29c和HT－29d细胞在裸大鼠体内建立转移模型，比较其与母系的转移能力。用ELISA法测定3个大肠癌细胞系的尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）及纤溶酶原抑制－1（PAI－1）含量；用免疫组化技术检测癌胚抗原和3－磷酸肌醇激酶（PI3－Kinase）在体内外的表达；用流式细胞仪测定癌胚抗原表达。结果：在裸鼠体内HT－29d细胞的肝转移率明显高于母系HT－29细胞，转移累及的脏器增多，在体外培养中，HT－29d细胞的uPA及PAI－1含量明显高于HT－29和WiDr细胞，在裸鼠体内HT－29d细胞的PI3－Kinase表达明显高于HT－29和WiDr细胞。结论：经裸鼠体内筛选的大肠癌HT－29细胞亚系表现出增强的肿瘤转移能力，UPA、PAI－1的含量及PI3－Kinase的表达与肿瘤转移能力有关。