应用旋转生物反应器和微载体技术体外大规模扩增人骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞 (ＭＳＣｓ)因其自身所具有的特殊性而日益受到关注[1,2 ] 。我们采用微载体技术在旋转生物反应器内扩增人骨髓间充质干细胞。一、材料与方法1.试剂 :细胞培养基ＤＭＥＭ购自美国Ｇｉｂｃｏ公司 ;旋转生物反应器购自美国Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ公司。2 .ＭＳＣｓ的分离与培养 :骨髓来源于正常献髓者 ,将人骨髓经ＤＭＥＭ稀释后用一种细胞分离液Ｐｅｒｃｏｌｌ分离 ,Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液的比重为 10 73 ｇ/Ｌ。分离后收获单个核细胞 ,ＤＭＥＭ洗 2次 ,接种于 2 4孔板内 ,浓度为 2 .0× 10 5个 /ｃｍ2 ,各孔内加入 10 %胎牛血清 …     

旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损

目的 探索旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)组织工程法及BMSCs与PHB的复合支架修复兔下颌骨缺损的可行性.方法 体外分离纯化BMSCs,在旋转生物反应器内,利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上,以修复兔的下颌骨缺损区,此为实验A组;以未对缺损区进行修复为对照B组;以单纯PHB修复缺损区为对照C组.分别于修复术后第3、8、14、42、84天处死每组兔2只,对缺损区行组织学检查、骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片.结果 第84天,A组的大部分修复材料被骨性组织取代;B组的缺损区未修复;A组修复骨缺损的效率较C组高.结论 在旋转生物反应器内,应用微载体技术可以成功地进行BMSCs的培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要;PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损.     

旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损

目的探索旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)组织工程法及BM-SCs与PHB的复合支架修复兔下颌骨缺损的可行性。方法体外分离纯化BMSCs,在旋转生物反应器内,利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上,以修复兔的下颌骨缺损区,此为实验A组;以未对缺损区进行修复为对照B组;以单纯PHB修复缺损区为对照C组。分别于修复术后第3、8、14、42、84天处死每组兔2只,对缺损区行组织学检查、骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片。结果第84天,A组的大部分修复材料被骨性组织取代;B组的缺损区未修复;A组修复骨缺损的效率较C组高。结论在旋转生物反应器内,应用微载体技术可以成功地进行BMSCs的培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要;PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损。     

应用旋转生物反应器开展软骨组织工程研究

目的：应用旋转生物反应器（RCCS）在体外条件下培养具有一定形状的组织工程化人工软骨,以便为软骨组织工程产品产业化生产奠定基础。方法：将兔关节软骨细胞接种到圆形或方形可降解聚合物材料上,然后在RCCS内进行培养,并以在培养瓶内培养复合体为对照组。在体外培养期间,对复合体培育产物氨基糖胺聚糖（GAG）及DNA含量进行定量测量。经体外培养后,将复合体植入到裸鼠背部皮下,术后不同时间取材,进行大体、组织学等检查。结果：经RCCS培养的复合体在体外培养期间以及体内植入后均有明显软骨形成,而对照组则仅见少量软骨形成。复合体体外培育产物检测结果表明,在RCCS内培育的复合体GAG和DNA含量明显高于对照组。结论：RCCS与以单层生长方式为主的传统细胞培养装置－培养瓶相比,能够提供更适宜的外部环境,从而有利于软骨细胞在支架内形成人工软骨组织。     

关节软骨组织工程种子细胞的研究进展

目的 综述关节软骨组织工程种子细胞的研究进展.方法 广泛查阅近年来有关关节软骨组织工程种子细胞的文献,并进行综述.结果 BMSCs分化为软骨细胞将成为关节软骨组织工程种子细胞的主要来源,与支架利用和培养环境改善构成关节软骨组织工程的重要条件.结论 充分利用细胞因子和转基因技术,改良三维支架和培养条件,将推动关节软骨组织技术的进展.     

软骨组织工程种子细胞源的研究进展

多种原因造成的关节软骨病变比较常见,软骨损伤后缺乏自愈能力,软骨缺损的修复一直是临床的难题。随着细胞生物学和材料科学的迅速发展,应用组织工程学技术修复软骨病损已成为可能,而优化种子细胞源是应用这一技术的前提和关键[1]。本文就有关软骨组织工程种子细胞源的优化获取、存在的问题及其解决等研究进展作一综述。1软骨组织工程对种子细胞源的要求组织工程软骨的种子细胞应符合下列要求:来源丰富,取材方便;有较强的增殖传代能力;与载体材料接种后能保持增殖能力和较高的黏附率,植入受区后能保持修复组织的表型;对机体或供区损伤小,临…     

生长因子与组织工程软骨种子细胞的研究

组织工程是继细胞生物学和分子生物学之后 ,生命科学发展史上又一新的里程碑 ,标志着医学初步进入制造组织和器官的新时代。软骨则是第一种获得成功的组织工程化组织 ,也是当前组织工程研究的热点。由于利用组织工程技术修复软骨缺损 ,往往需要大量的细胞 (如耳缺损 ) ,而软骨细胞属于终末分化细胞 ,在体外扩增有限 ,且经过一段时间后 ,细胞开始老化 ,表型发生改变 ,转变为类成纤维细胞 ,由表达Ⅱ型胶原 ,转而表达Ⅰ、Ⅲ型胶原基质 ,丧失成软骨功能。因此如何防止细胞功能老化 ,寻求广泛的种子细胞来源 ,是软骨组织工程研究中首要解决的关键…     

人脐血造血干/祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验

目的 利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,并通过动物移植实验检验该方法的有效性.方法 采集抗凝脐血10份,分离出单个核细胞(MNC),分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养.检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达,并进行造血干/祖细胞集落的培养.取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠,以X射线照射后,分为4组,其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC;静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞;反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞;空白对照组小鼠注射生理盐水.移植后6周处死存活小鼠,收集骨髓细胞,检测其中CD45+、CD3+、CD19+和CD33+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 生物反应器扩增前MNC为(1.2～2.8)×108个,扩增后为(3.7～12.6)×108个,扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者(P<0.01).经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者(P<0.05).移植6周后,空白对照组小鼠均死亡,MNC组存活率为35%,静态扩增组存活率为30%,反应器扩增组存活率为62.9%,后者明显高于前二者(P<0.05).各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达以及人源CD33+、CD45+、CD3+及CD19+细胞.结论 利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,所得细胞能植入小鼠体内,并能获得造血功能重建.     

组织工程皮肤种子细胞的研究进展

组织工程即应用细胞生物学与工程学的原理和技术,在正确认识哺乳动物正常及病理条件下组织结构和功能的基础上,研究和开发用于修复、维护和改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代物的学科。组织工程包括3个基本的要素：种子细胞（seed cell）、可降解的支架材料及讯息因子。组织工程皮肤作为组织工程研究中较为活跃的领域,是在无细胞的生物材料中引入特定的种子细胞,通过一定的组织构建,形成更加接近于人体组织结构的生物活性替代物。种子细胞作为组织工程的基本要素,其黏附、增殖能力、分化程度及免疫特性是生物活性皮肤构建过程中需重点考虑的问题。目前用于皮肤组织工程构建的种子细胞主要包括：表皮细胞、成纤维细胞、干细胞等。     

关节软骨组织工程修复的种子细胞

随着材料学、细胞生物学、工程学以及相关物理、化学学科的发展,一种新的关节软骨缺损的修复方法-组织工程逐渐被提出并应用,本文就应用软骨组织工程技术修复关节缺损中种子细胞的研究进展进行综述。     

血流力学对组织工程心脏瓣膜种子细胞形态及功能的影响

目的观察血流力学对组织工程心脏瓣膜种子细胞形态及功能的影响。方法从犬骨髓中分离得到骨髓间充质细胞（MSCs），经DiI标记后接种于去细胞猪主动脉瓣膜支架，培养7d后将所得瓣叶种植于犬腹主动脉内，术后4、8、12周取材，进行HE染色、天狼猩红染色、免疫组织化学染色及超微电镜检查等，观察细胞生长、形态及功能变化。设体外培养组为对照组。结果接种骨髓间充质细胞的去细胞猪主动脉瓣膜支架，移植于犬腹主动脉内后，仍可检测到所种植细胞，细胞生长良好。与对照组比较，细胞形态有所伸长，整体上沿流体方向改变形态，同时，瓣叶组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显增加，并充满中性和酸性黏多糖。结论构建组织工程心脏瓣膜时，血流力学对种子细胞维持形态、保持功能起着重要作用。     

可注射性组织工程软骨源性微载体的微观结构及其生物相容性观察

[目的]改进软骨源性微载体的制备方法.对其微观结构特征及其与骨髓间充质细胞的生物相容性进行观察,探索新的可注射性组织工程软骨的制备方法.[方法]将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎,梯度离心后制备成150～300 μm的颗粒,去细胞处理后采用常规组织学方法观察软骨微粒的空间结构及化学组成,采用扫描电镜观察软骨源性微载体的形态特征,随后体外获取扩增骨髓间充质细胞,与软骨微粒复合,然后采用旋转式生物反应器扩增,构建可注射性组织工程软骨细胞.[结果]本研究制备的软骨微粒呈圆形或椭圆形,表面呈毛刷状结构,主要成分是Ⅱ型胶原和GAG,而毛刷的主要成份Ⅱ型胶原、骨髓间充质干细胞不仅与微载体结合良好,还能够在其表面大量扩增.[结论]与传统的微载体不同,软骨源性微载体与细胞复合后,不需要再将细胞消化,避免了软骨细胞外基质的损失,可以作为可注射性组织工程软骨的理想材料和方法.     

血管组织工程种子细胞的建立及意义

目的：利用人Nanog基因转染血管组织工程的种子细胞（血管内皮细胞ECV304）,提高其增殖能力,以在较短时间内获得大量种子细胞,从而为克服血管组织工程种子细胞来源的匮乏及组织工程血管的快速构建提供新途径。方法：制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog,用rAAV2-hNanog转染ECV304细胞,然后采用RT-PCR检测hNanog基因在转染的ECV304细胞中的表达,再用MTT、免疫荧光及激光共聚焦技术检测hNanog基因对血管内皮细胞ECV304生长的影响。结果：（1）rAAV2-hNanog转染ECV304细胞后,RT-PCR检测表明hNanog基因能在血管内皮细胞ECV304中稳定表达;同时,血管内皮细胞在转染后的增殖能力也显著增强（P〈0.05）。光镜下观察发现,转染的血管内皮细胞的形态无明显改变。结论：转染hNanog基因后,血管内皮细胞的形态无显著变化,但其增殖能力明显增强。利用hNanog基因提高血管内皮细胞的增殖能力,能够克服血管组织工程种子细胞来源不足的瓶颈,为组织工程血管的快速构建及应用提供一种新的方法。     

组织工程骨的研究成果及存在的问题

自1980年成骨细胞分离培养成功以后，大大提高了成骨细胞生物学特性的认识。以后随着医学生物材料学的发展和“组织工程”概念的提出。在体外构建有生命的组织工程骨得到了迅速发展，并已有临床初步应用的报道。经过近20年的研究历程，逐渐使组织工程骨的研究问题集中在种子细胞优选，人工细胞外基质的三维组合，组织工程骨的体外构建技术及细胞与材料的相互作用，     

骨组织工程种子细胞的研究及应用进展

骨组织缺损是外科临床常见的疾病之一。临床植骨术已成为仅次于输血术的组织移植技术。但目前主要应用的自体骨移植、异体骨移植及人工替代品移植技术难以满足临床上各种骨缺损修复的需要。近20年来，随着生物材料、组织工程技术及理论的发展。将骨组织工程技术应用于临床已成为修复骨缺损的趋势。近年来骨组织工程研究发展迅速，已成为最有希望首先进入临床应用的组织工程技术之一。其中，种子细胞的选择、支架材料的制备、细胞与支架的相互作用以及辅以何种生长因子是近年来研究的核心问题。笔者就当前骨组织工程种子细胞的研究及应用情况作一综述。     

组织工程的发展与未来

“组织工程”概念提出至今已有20年了。回顾20年发展进程，在种子细胞、三维支架材料、生物活性因子、组织构建、体内植入等方面已取得很大进展，并有一些临床应用的实例证明组织工程的研究路线是正确的，展现了良好的产业化前景。     

干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究进展

种子细胞是目前软骨组织工程研究的重点之一.目前,报道的软骨组织工程种子细胞主要包括:自体软骨细胞、异体软骨细胞、基因修饰的永生化软骨细胞及各种来源的干细胞.自体软骨细胞来源有限,且体外培养传代会发生"去分化 (dedifferentiation)"现象[1],丧失增殖和分泌基质的能力,这严重限制了其作为种子细胞的应用;     

骨组织工程基础研究与临床应用:回顾与展望

组织工程学作为21世纪生命科学领域的重大前沿课题，至今仅20余年的发展时间里，在种子细胞、生物材料、组织构建及临床初步应用等方面已取得颇多具有重大价值的成果。时至今日，组织工程研发的部分产品已进入临床，更有产品已实现了规模化生产和上市销售（如美国的组织工程皮肤和软骨产品），而经典组织工程骨目前已进入了临床研究阶段，出现了一系列可喜的研究成果。现结合国内外骨组织工程基础研究和临床应用作回顾与展望。     

组织工程骨软骨复合体的研究进展及展望

随着材料科学、细胞生物学、力学生物学以及生物反应器技术的进步，采用组织工程的方法构建合适形状和大小的组织工程骨软骨复合体为骨软骨复合缺损的修复提供了新的希望。本文将对这一领域进行综述。     

流式细胞技术在组织工程研究中的应用

组织工程(Tissue Engineering)是近年来正在兴起的一门新兴学科,它应用生命科学和工程学的原理与技术,在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上,研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学.