人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 ,分化的神经元较少且稍欠成熟     

兔垂体干细胞的培养鉴定及分化

背景：脑垂体是人体重要的内分泌器官。多种疾病可引起脑垂体损伤，如脑垂体瘤、垂体功能减退症等。垂体干细胞因具有自我更新和多向分化潜力的特性，有望成为一种新的治疗方式修复受损的垂体。目的：采用悬浮细胞球培养法分离培养垂体干细胞，鉴定其增殖及分化能力。方法：采用悬浮细胞球培养法从新生新西兰白兔垂体中分离培养垂体干细胞，观察其形态特征；免疫荧光细胞染色检测垂体干细胞标志蛋白SOX2及Nestin的表达；采用EdU标记法检测垂体干细胞增殖能力；经贴壁及诱导分化后，通过ELISA法检测培养基中的激素水平。结果与结论：通过悬浮细胞球培养法可成功分离得到垂体干细胞球，且具有较强的增殖能力；干细胞特异性标记物SOX2和Nestin阳性表达；经诱导分化后培养基中促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素、促黄体生成激素、促卵泡素、催乳素水平显著升高(P <0.001)，具有较强的分化能力。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化

目的　从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞 ,并从中纯化神经元前体细胞。　方法　利用无血清培养从胚胎 4个月的胎儿海马区分离细胞 ,并在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (nestin)的表达、经BrdU孵育后的BrdU表达 ;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异 ;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞。　结果　分离的细胞具有连续克隆能力 ,在体外培养了 16个月 ,传了 4 3代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性 ;培养的细胞呈Nestin阳性 ,在BrdU孵育后呈BrdU阳性 ,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP ;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占 80 % ,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于 90 %。利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin ,并且全部分化成神经元。　结论　从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能 ,属于神经干细胞 ,从中可纯化出神经元前体细胞     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法将新鲜分离的胚胎(自然流产胎儿4~6周,经志愿者知情同意)无菌条件下取海马,采用无血清培养基进行培养,原代培养的细胞增殖成神经干细胞球,倒置显微镜观察细胞的形态学,并用免疫荧光方法对神经干细胞进行自我更新能力(Brd U)的鉴定及特异性抗原Nestin的检测。结果培养5~7d的神经干细胞球呈桑葚样悬浮生长,呈明显的Brd U阳性反应,其具有增殖能力;神经干细胞表达了Nestin抗原阳性。结论人胚胎神经干细胞具有神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。 目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。 方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用MTT比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。 结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化

背景：脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点,通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得,但是存在着操作繁琐,花费高等不足。 目的：观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织,组织块法分离培养脂肪源性干细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。 结果与结论：组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞生长为主,呈漩涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈抛物线形;细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达,CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞,且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养,能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能,可以满足组织工程研究种子细胞的需求。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人胚胎大脑皮层神经干细胞的分离培养

目的　为人神经干细胞的基础研究及临床应用提供细胞模型。　方法　采用无血清培养技术 ,分离培养了 10～ 14周人胚大脑皮层细胞 ,并用神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)免疫组化鉴定培养细胞 ;5 %胎牛血清诱导其分化 ,神经丝 2 0 0 (NF 2 0 0 )和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组化鉴定分化细胞。　结果　获得了大量未分化、呈簇状悬浮生长的神经干细胞团 ,且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞。经传 12代后仍具干细胞特性。　结论　本实验成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞 ,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

嗅黏膜神经干细胞的体外培养和向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化

目的:建立体外培养和诱导嗅黏膜神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的方法,探讨该细胞的干性和分化特性。方法:首先用含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养成年大鼠嗅黏膜细胞,当细胞贴壁后将培养基更换为含表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),不含血清的干细胞培养基,以促进干细胞增殖形成神经球。将神经球取出用干细胞培养基悬浮培养以纯化扩增神经干细胞。应用干细胞相关蛋白Nestin及CD133的抗体对神经干细胞进行免疫荧光染色,观察上述蛋白在细胞的表达。用Neurobasal培养基(含B27、NGF、ATRA及SHH)培养扩增后的神经干细胞,诱导其向神经元分化。用神经丝蛋白(neurofilament-200,NF-200)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体对分化的细胞进行免疫荧光染色;用免疫印迹法检测上述细胞裂解样品内的相应标志蛋白的电泳条带。结果:嗅黏膜神经干细胞高表达Nestin及CD133两种神经干细胞标志蛋白;干细胞经诱导分化后其形态具有神经元特征,并且高表达NF和TH两种神经细胞标志蛋白。结论:贴壁/悬浮序贯培养方法可体外纯化扩增嗅黏膜神经干细胞,该细胞可分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元。     

水凝胶三维培养对神经干细胞增殖特性及分化潜能的研究实验

目的:观察对比神经干细胞（NSC）在Matrigel水凝胶培养和悬浮培养的神经干细胞的生长形态、增殖、分化潜能、细胞产量及存活率等情况。方法:分离提取孕12~13 d胎鼠大脑组织中的神经干细胞,用悬浮培养、三维Matrigel水凝胶支架培养2种培养方案传代神经干细胞,分别进行形态学观察分析,免疫组织化学荧光术鉴定巢蛋白...     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2 以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

成年小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及分化

目的:建立一种简便易行的从成年小鼠脑组织分离、培养和鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法,为相关研究提供新的研究手段。方法:采用机械分离和酶消化结合方法分离成年昆明种小鼠的脑组织,用无血清培养基悬浮培养;倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)观察NSCs的自我增殖能力;免疫荧光细胞化学技术检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达;多聚赖氨酸铺板和撤除培养基中FGF和EGF的条件下,给予5%血清和1μm维甲酸诱导NSCs分化,免疫荧光细胞化学技术检测GFAP(标记胶质细胞),β-tubulin Ⅲ(标记神经元)蛋白的表达来测定NSCs的分化能力。结果:从成年小鼠脑组织分离的细胞,在无血清培养液中可形成神经球,并可在体外扩增和连续传代,免疫荧光细胞化学表明神经球Nestin阳性表达,在给予血清和维甲酸条件下神经球可表达GFAP和β-tubulin Ⅲ。结论:本研究成功建立了体外培养成年小鼠脑组织分离和培养NSCs的方法,培养的NSCs具有自我更新、增殖及多向分化潜能。此方法是一个稳定、简便易行的方法,可广泛用于神经干细胞相关的基础和应用研究。     

脊髓发育和损伤修复过程中巢蛋白的作用及机制

背景：巢蛋白作为一种神经元特异标记物,其表达活性在一定程度上反映了脊髓神经细胞增殖、分化、迁移的演变规律。 目的：综述巢蛋白的分子结构、生物学功能及其在脊髓发育及损伤修复中的表达分布规律,进而为脊髓损伤后神经干细胞的移植治疗提供前期研究基础。 方法：应用计算机检索1990至2012年维普、万方数据库相关文章,检索词为“脊髓,巢蛋白”,并限定文章语言种类为中文。同时计算机检索1990至2012年PubMed和Springer外文电子期刊及电子图书(全文)数据库相关文章,检索词为“spinal cord,nestin”,并限定文章语言种类为English。共检索到文献343篇,最终纳入符合标准的文献35篇。 结果与结论：作为神经干细胞的分子标记物之一,巢蛋白在胚胎期呈现时空性表达,与神经前体细胞的发育成熟程度呈反相关,即随着神经细胞分化发育的不断成熟,其表达强度则会逐渐减弱甚至消失。在脊髓损伤等病理情况下,受损组织区内巢蛋白的表达强度和数量能够反映损伤脊髓组织的修复能力。故脊髓组织发育过程中巢蛋白的表达强度、数量及分布现已作为判断脊髓神经细胞发育的一项重要指标,为临床脊髓损伤治疗提供重要前期研究基础。     

过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

BACKGROUND:Genetic modification by Shootin1 aims to effectively improve neural differentiation of bone marrow mesechymal stem cells (BMSCs) in the injured spinal cord, thereby promoting functional recovery from spinal cord injury after cell transplantation. OBJECTIVE:To explore the nerve regeneration ability of transplanted BMSCs overexpressing Shootin1 in rats with spinal cord injury. METHODS:BMSCs were transfected using adenovirus-Shootin1 for 48 hours. Then, immunofluorescence staining was used to detect Nestin and NeuN expression levels in the transfected cells under in vitro neuronal induction and differentiation. Animal models of spinal cord injury were made in rats using modified Allen’s method. Thirty minutes later, Shootin1-transfected BMSCs and non-transfected BMSCs were respectively injected into the subarachnoid space of the rats in the transfection and non-transfection groups, respectively. Rats in the model group were given no treatment. Five weeks after modeling, spinal cord samples were taken from each rat to make frozen sections for detection of nerve related markers RESULTS AND CONCLUSION:After 48-hour adenoviral transfection, Shootin1 expression was successfully detected in BMSCs. After 7-day in vitro induction, the cell morphology in the three groups varied, and there was no significant difference in the expression of Nestin and NeuN between the transfection and non-transfection groups. Basso, Beattie and Bresnahan scores were higher in the two cell transplantation groups than the model group. Increased expression levels of Nestin, NeuN, GFAP, MAP-2, ChAT and SYN were observed in both two cell transplantation groups, indicating a strengthened ability of nerve regeneration. Our experimental findings further confirm that BMSCs transplantation for spinal cord injury has achieved good outcomes, and Shootin1 protein plays a certain role in nerve regeneration and functional recovery after spinal cord injury. However, Shootin1 overexpression shows no obvious additional effects in combination with BMSCs transplantation, and further studies on the optimization of BMSCs transplantation for spinal cord injury are necessary.     

Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞

目的:探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)直接重编程为神经干细胞的方法,为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)作为种子细胞治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。方法:逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后,悬浮、贴壁反复循环培养3次。Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。i NSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将i NSCs显微注射至小鼠大脑皮质,7~14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果:Real-time PCR显示i NSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高(P0.05),且i NSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示i NSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明i NSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。i NSCs具有自我更新的能力,且在体内外都具有三向分化潜能,可作为修复SCI合适的种子细胞。     

羊水干细胞定向及稳定分化为神经元样细胞体系的建立

文题释义： 羊水干细胞：羊水是由多种细胞组成的异质细胞群,其中包括胎儿脱落的表皮细胞、呼吸道上皮细胞、消化道和泌尿道等体腔管道的脱落细胞、羊膜脱落细胞等。羊水中包含有向内、中、外3个胚层分化潜能的干细胞,约占1%,近年来研究发现羊水干细胞在体外通过特殊的诱导微环境能够分化成多种不同类型的细胞,使羊水来源干细胞成为干细胞研究的一个新热点。 悬滴培养：与传统的二维培养模式不同,悬滴培养提供的三维环境有利于促进各种干细胞的增殖与分化,可以使细胞聚集,相互紧密接触,从而促进细胞之间的相互作用,进而提高或增强干细胞的生物学功能。羊水干细胞悬滴培养可形成拟胚体结构,具有较强的分化潜能,有助于提高定向诱导分化效率。 背景：利用干细胞分化代替受损神经元的设想,已经逐渐受到科研工作者的关注。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞虽然具有良好的神经元分化潜能,但由于接种活体动物具有致瘤性,限制了其进一步的深入研究。 目的：建立稳定的羊水干细胞分选、培养、成神经诱导分化体系,探讨其作为神经元再生种子细胞的可行性。 方法：经B超引导下,穿刺获取孕19-22周期间的羊水样本10 mL,磁珠分选其中c-Kit阳性的羊水干细胞。免疫荧光染色鉴定羊水干细胞标记物Oct-4、Sox2;RT-PCR检测羊水干细胞多次传代后干性标记物c-Kit、Oct-4、Sox2、Nestin的表达;羊水干细胞悬滴培养4 d观察拟胚体的形成情况;采用“两阶段”分步诱导羊水干细胞向神经元方向分化,免疫荧光染色观察Neuro D、Tuj1的表达。 结果与结论：①羊水中可分选出大约1%的c-Kit阳性羊水干细胞;②(75.0±4.6)%的羊水干细胞表达Oct-4,(86.0±2.8)%的羊水干细胞表达Sox2;③RT-PCR方法检测干性标记物c-Kit、Oct-4、Sox2、Nestin的表达量并不随细胞传代数的增加而改变;④经悬滴培养可形成拟胚体并表达Oct-4;⑤免疫荧光证实未经诱导的羊水干细胞表达神经元标记物Tuj1,但缺乏典型的神经元形态特征;RT-PCR证实不同羊水干细胞标本都能检测到Tuj1的表达,同一样本多次传代也能稳定检测到Tuj1的表达;⑥羊水干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3的两阶段分步诱导后表达神经干细胞标记物Neuro D和神经元标记物Tuj1,具有神经元样细胞的形态特征。 ORCID: 0000-0001-6488-2055(宗凌) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

培养胚胎神经干细胞移植入纹状体后的形态学观察

本研究的目的是 :将体外培养的小鼠胚胎大脑皮层和脊髓的神经干细胞经单细胞悬液微移植后观察其在大鼠纹状体的存活、迁移和分化的状况。实验在无血清条件下将这些细胞扩增、培养再经活细胞荧光染料 Di I标记后 ,采用微移植的方法 ,通过脑立体定位仪上用微玻璃针将干细胞分别植入成年大鼠双侧纹状体的对称部位。大鼠存活 8周后 ,经灌注固定、恒冷箱切片 ,在荧光显微镜下观察标记的移植细胞的迁移状况 ;用星形胶质细胞特异性抗体观察移植区 GFAP的表达 ,以显示移植细胞分化状况。结果表明 :来源于胚胎小鼠大脑皮层和脊髓的体外培养神经干细胞经微移植后 ,均可在成年大鼠脑内纹状体区域存活 ,移植的神经干细胞可向周围的脑实质内迁移 ,迁移细胞沿特定的纹状体结构分布。神经干细胞主要分化成星形胶质细胞。本实验结果提示 ,移植的神经干细胞可在脑实质内存活、迁移和分化。     

大鼠脊髓神经干细胞的鉴定及光镜和电镜观察

本研究应用无血清培养技术对分离的大鼠胚胎脊髓神经干细胞进行体外培养,在倒置显微镜和电镜下观察细胞形态,应用BrdU标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况。免疫荧光显示nestin、MAP2、GFAP以及BrdU/nestin、BrdU/MAP2、Br-dU/GFAP均有阳性表达,说明从大鼠胚胎脊髓可成功分离出神经干细胞,它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原。脊髓神经干细胞具有自我更新能力,能分化为神经元和星型胶质细胞。     

成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群体外可向神经元诱导分化

背景：神经干细胞具有多向分化潜能,可以分化为神经元和神经胶质细胞等,替代受损伤的脑细胞,达到修复神经损伤的目的。 目的：观察成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性细胞亚群的成神经诱导分化能力。 方法：取成年SD大鼠,麻醉后获取脑膜组织制备成细胞悬液,接种在培养皿中进行传代培养,进行Nestin免疫荧光染色。取第3代细胞,用含曲古抑菌素A的完全培养基进行成神经诱导培养,诱导7 d之后采用Westen blotting检测神经细胞相关标志性蛋白NF-200和BM88蛋白的表达。 结果与结论：培养24 h,脑膜细胞中有部分球形细胞发生悬浮,部分细胞出现贴壁生长现象。另外,还可以观察到部分散在球形细胞逐渐形成克隆球,随着体积的不断增大,生长速度呈现下降趋势。免疫细胞化学染色分析干细胞标记物Nestin呈强阳性表达,细胞核使用Hoechst染色之后,荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。成神经诱导7 d时相关标志性蛋白NF-200和BM88蛋白均呈明显表达。结果表明,成年SD大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群在体外诱导后能够向神经元方向发生分化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程      

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。