新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

大鼠海马神经干细胞体外增殖、凋亡和分化的激光扫描共焦显微镜观察

目的 采用激光扫描共焦显微镜观察体外培养胎鼠海马神经干细胞（NSCs）增殖、凋亡及其分化情况。方法 体外分离培养胚胎大鼠海马NSCs,把神经干细胞球培养在共焦显微镜专用培养皿中。用 Hoechst 33258染细胞核,免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白（Nestin）的表达以鉴定NSCs,检测神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白（β-Ⅲ tubulin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达以测定NSCs的分化能力。通过激光扫描共焦显微镜对神经干细胞球进行光学连续断层扫描,然后用软件进行三维重建,立体动态观察神经球。结果 通过激光扫描共焦显微镜观察到神经球     

新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

背景:从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞,建立起一套完整的神经干细胞培养体系,是进行神经干细胞研究的基础。目的:建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系,并对其生物学特性进行分析。方法:分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织,采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。结果与结论:从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案,为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。     

人参皂苷Rgl诱导大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

为探讨人参皂苷Rgl诱导新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的作用,本实验采用无血清和单克隆培养方法进行细胞培养,应用免疫荧光染色法观察NSCs的形态及其分化而来的神经元、胶质细胞的形态,并经图像扫描分析仪分析海马NSCs分化的细胞数量.实验分4组:5%胎牛血清组、5%胎牛血清+30 ms/kg人参皂苷Rgl组、5%胎牛血清+15 ms/kg人参皂苷Rgl组和5%胎牛血清+10mg/kg人参皂苷Rgl组.结果显示:海马NSCs在无血清培养下,可形成巢蛋白(nestin)和5-溴脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞球;在诱导分化后,免疫荧光染色可见B-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)与波形蛋白(vimentin)阳性细胞;图像扫描分析结果显示15 mg/kg人参皂苷Rgl干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.此结果提示在一定浓度人参皂苷Rgl的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多,为进一步研究人参皂苷Rgl对NSCs分化的影响提供了实验依据.     

星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离、培养与鉴定

背景：肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力,能够分化为成熟细胞表型的干细胞样细胞,对肿瘤发生、增殖、侵袭起关键作用。 目的：建立体外分离、培养与鉴定星形胶质细胞瘤干细胞的方法。 方法：采用直接培养法分离培养星形胶质细胞瘤干细胞。参照神经干细胞培养条件,进行体外培养。观察其增殖、分化并进行巢蛋白、CD133免疫细胞化学鉴定和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白及O4免疫细胞化学鉴定。 结果与结论：培养7-10 d,可形成大量悬浮生长巢蛋白及CD133免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白或O4免疫阳性。提示星形胶质细胞瘤中存在具有神经干细胞特性的肿瘤干细胞。CD133和巢蛋白是星形胶质细胞瘤干细胞重要的表面标记,可以用于星形胶质细胞瘤干细胞的分离。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点。而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化。 目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化。 方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定。 结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠。免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱。RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白mRNA的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱。说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞。     

胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化

目的　从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞 ,并从中纯化神经元前体细胞。　方法　利用无血清培养从胚胎 4个月的胎儿海马区分离细胞 ,并在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (nestin)的表达、经BrdU孵育后的BrdU表达 ;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异 ;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞。　结果　分离的细胞具有连续克隆能力 ,在体外培养了 16个月 ,传了 4 3代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性 ;培养的细胞呈Nestin阳性 ,在BrdU孵育后呈BrdU阳性 ,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP ;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占 80 % ,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于 90 %。利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin ,并且全部分化成神经元。　结论　从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能 ,属于神经干细胞 ,从中可纯化出神经元前体细胞     

胎儿脑组织体外保存获取神经干细胞的时限

目的　探讨人胎儿脑海马组织体外保存不同时限后培养获取神经干细胞的可行性。　方法　利用无血清培养 ,从死亡后孵育在 4℃Hank液 0h、4h、2 4h、4 8h、72h及 96h的胎儿海马分离细胞 ,在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学方法检测培养细胞的神经上皮干细胞蛋白 (nestin)表达、经BrdU孵育后的BrdU表达以及诱导分化后的神经元标记 (tubulin)或星型胶质细胞抗原 (GFAP)表达 ;比较不同时限的细胞在Nestin的表达、增殖能力和诱导分化后神经元及胶质细胞比例的差异。　结果　从保存在 4℃Hank液 72h以内的各组胎儿海马中均可获得具有连续增殖能力的神经球 ,培养出的细胞Nestin表达为阳性 ,通过BrdU的摄取表明细胞处于活跃的有丝分裂状态 ,在此期限内各组之间无明显差异 ;诱导分化后的神经元和胶质细胞比例在各组之间亦相似 ;但随着在Hank液中孵育时间的延长 ,所获得的神经球数量呈减少趋势 ;在 96h组则未能获得神经球。　结论　人胎儿海马组织在 4℃Hank液中孵育 72h内可培养出呈神经球样生长的神经干细胞 ,但神经球数量与孵育时间呈负相关     

异氟醚对新生大鼠海马神经干细胞增殖及分化的影响

BACKGROUND: Isoflurane is an anesthesia drug that has a certain effect on the nervous system. It possibly causes neurologic disorders through impacting nerve stem cell function or morphology. OBJECTIVE: To investigate the effects of isoflurane on the proliferation and differentiation of neural stem cells in the hippocampus of rats. METHODS: Neural stem cells from the hippocampus of neonatal Sprague-Dawley rats, aged 7 days, were induced and differentiated. Passage 3 cells were obtained and divided into two groups: isoflurane group (a mixture gas of 2.8% isoflurane, 5% CO2 and 95% O2) and control group (a mixture of 5% CO2 and 95% O2). After  intervention of 6 hours followed by 2 hours of routine culture, anti-BrdU monoclonal antibody immunofluorescent staining was used to detect cell proliferation, and western blot assay to detect the expression of β3-tubulin and glial fibrillary acidic protein. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the number of BrdU positive cells in the isoflurane group reduced significantly, indicating that isoflurane inhibits the proliferation of neural stem cells. Compared with the control group, the expression of glial fibrillary acidic protein in the isoflurane group up-regulated, but the expression of β3-tubulin had no changes, indicating isoflurane promotes the differentiation of neural stem cells into astrocytes.       

人类胚胎来源成肌细胞的培养和鉴定

背景：人类胚胎骨骼肌含有成肌细胞,其在体外条件下的培养及在体外能否融合形成肌管,以及表达的相应的标志物,目前尚不明确。 目的：验证源于人类胚胎骨骼肌的成肌细胞在体外条件下的培养条件,能否在体外融合形成肌管,能否表达神经细胞的标志物。 方法：采用组织块培养法对人类胚胎肌肉来源的成肌细胞进行原代培养,以免疫细胞化学染色检测培养的细胞肌肉细胞标志物desmin、myogenin、平滑肌肌动蛋白、myosin和神经细胞标志物β-tubulin Ⅲ、nestin、neurofilament 200 (NF200)、胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：从人类胚胎肌肉组织中成功培养出成肌细胞,表达成肌细胞的标志物desmin和myogenin,同时也表达神经元特异性烯醇化酶、nestin和NF200,细胞能够在体外融合形成含有多个细胞核的肌管,融合的肌管可以表达NF200、β-tubulin Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白等神经细胞的标志物。结果证实,人类胚胎肌肉来源的成肌细胞能够同时表达神经细胞和肌肉细胞的标志物,培养的成肌细胞和肌管细胞表达神经元特异性烯醇化酶、β-tubulin Ⅲ、nestin、NF 200和胶质纤维酸性蛋白。说明这几种神经细胞标志物不能用于肌肉来源的细胞向神经细胞跨分化的鉴定研究。     

体外诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞

目的探讨成人成肌细胞在体外能否转化为神经前体细胞。方法从成人正常颞肌分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第三代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液诱导分化,观察诱导后细胞的形态变化,并进行免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析。结果成肌细胞经诱导后聚集成球,悬浮生长。免疫细胞化学染色见细胞球表达巢蛋白,5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验阳性;细胞分化后表达神经丝蛋白68,胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂。RT-PCR分析结果与免疫细胞化学染色结果一致。结论成人成肌细胞在体外一定条件下诱导能够转化为神经前体细胞。     

糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

背景：缺氧作为神经系统疾病发展过程中诸多病理因素中最常见的因素之一,对于内源性神经干细胞以及移植后外源性神经干细胞的存活、迁移、分化、凋亡发挥着诸多调控作用。 目的：系统观察糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响。 方法：从新生鼠嗅球分离培养出神经干细胞,建立糖氧剥夺模型,免疫荧光技术检测糖氧剥夺后神经干细胞分化能力,MTT法检测糖氧剥夺24,48 h后恢复正常条件培养对神经干细胞增殖能力的影响,Hochest33258荧光染色检测糖氧剥夺24,48 h后神经干细胞凋亡状况。 结果与结论：第4代神经干细胞CD133免疫荧光鉴定结果呈阳性表达,MTT细胞增殖能力检测结果示：糖氧剥夺组增殖能力明显低于常氧组(P < 0.05),糖氧剥夺48 h组增殖能力低于糖氧剥夺24 h组(P < 0.05)。GFAP、β-Tubulin Ⅲ细胞免疫荧光染色结果示糖氧剥夺48 h后神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元总数明显低于常氧组(P < 0.05)。Hochest33258染色凋亡率检测结果示糖氧剥夺组细胞凋亡率明显高于常氧组(P < 0.01),糖氧剥夺48 h组神经干细胞凋亡率显著高于糖氧剥夺24 h组(P < 0.01)。上述结果表明糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡造成不利影响,影响程度取决于缺氧浓度、缺氧时间及自身对于缺氧的耐受性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

GDNF promotes neuronal differentiation and dopaminergic development of mouse mesencephalic neurospheres

In the present study we report establishment of a neurosphere culture system derived from mouse ventral mesencephalon at embryonic day 12 and investigate effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the differentiation potential of the neurospheres. The generated neurospheres exhibit stem cell characteristics, i.e. self-renewal capacity and multipotency. Addition of exogenous GDNF resulted in neural differentiation indicated by reduced number of nestin positive cells. GDNF treatment resulted in increased numbers of beta-III-tubulin immunoreactive cells whereas glial fibrillary acidic protein immunoreactivity was not effected. Most importantly, cell numbers expressing early dopaminergic markers, Nurr1 and Ptx3, were significantly higher in GDNF-treated spheres. We conclude that GDNF promotes differentiation of mouse mesencephalic stem cells towards neuronal lineage and most notably dopaminergic development.     

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的:探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性。方法: ESCs经胚胎体阶段, 以视黄酸及视网膜müller细胞诱导, 在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增7d, 观察形态变化, 采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物, 并对其扩增及分化能力进行观察。 结果:ESCs经初级诱导, NSCs选择性培养基筛选培养7d后, 形成大量神经球样结构, 可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性, 整合BrdU, 表达nestin、glutaminase、Brn-3基因, 且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论:视黄酸及müller细胞诱导的ESCs, 经选择性培养基筛选培养可获得NSCs, 有望为青光眼等神经变性疾病提供新的治疗途径。     

脊髓神经管神经上皮干细胞的分离培养和诱导分化

目的：从胚胎大鼠脊髓神经管中分离神经上皮干细胞并诱导其向多巴胺能神经元方向分化。方法：利用无血清悬浮培养、单细胞克隆技术分离神经上皮干细胞；采用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记新生细胞，免疫细胞化学单标或双标染色技术，检测神经上皮干细胞蛋白（nestin）和分化后特异性神经细胞抗原的表达；用纹状体组织提取液，诱导神经上皮干细胞向多巴胺能神经元方向分化。结果：从胚胎大鼠脊髓神经管 中分离的细胞可以连续传代，表达nestin，它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；与对照组3％相比，纹状体组织提取液可以诱导这些细胞中的12％分化成为多巴胺能神经元。结论：分离自脊髓神经管的细胞具有自我更新能力和多分化潜能（multipotent)，是增殖能力很强的神经干细胞；这些干细胞在一定的体外环境中能被诱导成为特定的神经元，提示其可以为神经移植提供材料。