羊膜细胞外基质的制备与保存研究

我们在羊膜建库研究过程中发现羊膜细胞外基质(amnioticextracellularmatrix ,AECM )是一种极为特殊的细胞外基质(extracellularmatrix ,ECM )。现将AECM的制备与保存方法报告如下。1　材料与方法1.1　材料取乙肝病毒、丙肝病毒、衣原体、人免疫缺陷病毒、梅毒检测均为阴性的健     

新鲜羊膜、冻干羊膜、羊膜细胞外基质的形态研究

目的：从组织形态学角度观察、比较新鲜羊膜(Fresh amniotic membrane，FSAM)、冻干羊膜(Frozen amniotic membrane，FZAM)、羊膜细胞外基质(Amniotic extracellular matrix,AECM)的结构特点。方法：采用目前国际公认的羊膜制备与保存方法，制备FSAM、FZAM、AECM，分别经HE、PAS组织染色、透射电子显微镜、扫描电子显微镜检查，观察并比较它们的形态与结构特点。结果：FSAM、FZAM在光镜和电镜下均与正常球结膜组织结构相近。两者形态上的主要差别表现在上皮细胞的结构变化上。而AECM结构较为独特，无细胞结构，其主要成分为胶原纤维、网状纤维和基质。结论：从组织结构特点分析，FSAM、FZAM、AECM是目前较为理想的结膜替代材料并可有效地用于角、结膜表面重建；同时，AECM作为一种极为特殊的细胞外基质，有重要的研究与应用价值。     

自制染色干燥细胞外基质胶羊膜生物学特性及修补结膜缺损的实验研究

目的　研究自制染色干燥细胞外基质胶羊膜（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ,ＥＣＭ－ＡＭ）的生物活性因子表达情况、生物力学特征以及在兔结膜修补术中的应用效果。方法　使用光镜和ＨＥ染色对自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ进行形态学观察,并通过免疫荧光染色对比其与单纯冻干羊膜中不同生物活性因子Ｌａｍｉｎｉｎ５、β－ｃａｔｅｎｉｎ和ＣｏｌｌａｇｅｎⅣ的表达情况。利用负荷传感器对比自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ与单纯冻干羊膜的最大承受拉伸力、弹性模量和拉伸长度,且把保存１２个月的自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ应用于兔羊膜－结膜修补术,并在术后２周观察兔结膜愈合情况。结果　自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ可以分辨羊膜的折叠处、皱褶及边缘,ＨＥ染色表明自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ基底膜的完整度和厚度均优于保存相应天数（１２个月）的冻干羊膜。保存１２个月的自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ中Ｌａｍｉｎｉｎ５、β－ｃａｔｅｎｉｎ和ＣｏｌｌａｇｅｎⅣ均比单纯冻干羊膜要高。自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ的最大承受拉伸力以及弹性模量均明显高于于单纯冻干羊膜（均为Ｐ＜０．０５）,但二者平均拉伸长度上差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ常温保存１２个月后应用于兔羊膜－结膜修补术,术后２周羊膜上有兔结膜上皮长入且Ｋ１９分布于整个结膜上皮细胞,并无明显的排斥反应和炎症反应。结论　自制染色干燥ＥＣＭ－ＡＭ含有丰富的生物活性因子,具有优越的生物力学特性,为眼表重建提供了更加安全有效的材料。     

结膜细胞外基质（ECM）的研究

目的 研究异体脱细胞结膜细胞外基质（ＥＣＭ）的特点以及其在结膜成形中的作用。方法 将兔结膜脱细胞处理后制成结膜ＥＣＭ,并用其修补结膜缺损区。术后３天及１,２,４,８周行光镜,电镜,免疫组化及淋巴细胞毒检查。结果 实验组移植后４周时移植片存活似正常结膜组织。８周时结膜上皮完全覆盖移植片,其超微结构与正常结膜上皮细胞基本一致。免疫组化检查证实ＥＣＭ移植前后为Ⅰ型和Ⅳ型胶原。淋巴细胞毒试验结果为无明显体     

羊膜和细胞外基质对兔眼小梁切除术后滤过泡的影响

目的探讨羊膜和结膜细胞外基质（ECM）对兔眼小梁切除术后滤过泡的影响。方法对27只新西兰白兔右眼后房注射α-糜蛋白酶,制备青光眼动物模型。将兔随机分为对照组、羊膜组、结膜ECM组,每组9只兔,行右眼手术。对照组行单纯小梁切除术,羊膜组行小梁切除联合羊膜移植术,结膜ECM组行小梁切除联合ECM移植。术后第1、7、14、21、28、35、42、56天观察小梁滤过泡形态及功能并测量术眼眼压,光学显微镜下观察小梁滤过泡下细胞的形态。结果对照组术前平均眼压（34．59±4．44）mmHg（1mmHg=0．133kPa）,术后第1、7、14、28、42、56天眼压分别为（11．31±2．76）mmHg、（19．20±5．17）mmHg、（21．17±4．36）mmHg、（22．22±1．39）mmHg、（23．90±1．97）mmHg、（23．67±1．73）mmHg。羊膜组术前平均眼压（34．38±4．20）mmHg,术后第1、7、14、28、42、56天眼压分别为（10．48±2．45）mmHg、（12．80±3．41）mmHg、（13．50±2．25）mmHg、（16．17±1．73）mmHg、（17．22±1．32）mmHg、（16．71±1．52）mmHg。结膜ECM组术前平均眼压（34．66±4．49）mmHg,术后第1、7、14、28、42、56天眼压分别为（10．94±2．75）mmHg、（11．29±2．40）mmHg、（13．93±3．55）mmHg、（15．63±3．54）mmHg、（15．70±2．44）mmHg、（15．12±3．65）mmHg。术后对照组与羊膜组和结膜ECM组眼压比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;羊膜组与结膜ECM组眼压比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。羊膜组、结膜ECM组术后第42、56天滤过泡轻微隆起并弥散,有较好的滤过功能。对照组术后第14、21天滤过泡区瘢痕形成,滤过功能差。组织学切片观察显示羊膜组、结膜ECM组滤过泡未形成瘢痕,成纤维细胞少,但有炎性细胞浸润。结论羊膜和结膜ECM能改善小梁切除术后滤过泡功能,减少瘢痕形成。     

结膜细胞外基质移植的实验研究与临床应用

目的：观察细胞外基质（extracellular matrix,ECM)作为结膜组织的替代材料用于结膜成形的特点及临床疗效。方法：将30只兔制作结膜损模型,并将其随机分为3组,实验 兔结膜采用组织工程技术制备的结膜ECM行结膜移植修补术,对照Ⅰ组采用新鲜异体结膜移植,对照Ⅱ组采用深低温冷冻的异体结膜,以移植修补术后结结膜成形的情况,并行镜下,免疫组化及淋巴细胞毒检查。同时将结膜ECM应用于7例烧伤后睑球粘连患者,行结膜囊成形＋结膜ECM移植术,观察其疗效。结果：动物实验组,结膜ECM移植后1周可见新生血管自移植片边缘长入,8周时外观已接近正常结膜,无免疫排斥反应;光镜下可见移植后4周时的移植区上皮已接近正常结膜上皮,电镜下,术后8周可见再生的结膜上皮细胞超微结构与正常结膜上皮细胞基本一致,对照Ⅰ组术后2周时,移植片可见大量炎性细胞浸润,对照组Ⅱ术后4周时,移植区仍有部分上皮未覆盖。7例患者结膜ECM移植术后1－2周可见新生血管长入植片;2个月时,结膜组织与正常结膜组织相近,术后随访9－26个月,平均18．3个月,结膜ECM植片存活良好,睑球粘连明显改善,已形成穹隆部,移植区在本恢复正常颜色。结论：结膜ECM为目前理想的结膜替代材料。     

甘油保存羊膜在结膜重建中的临床应用

目的：分析甘油保存羊膜移植重建结膜的基本条件和手术方法，并评价手术疗效。 方法：对11例不同眼部疾病患者采用甘油保存人羊膜进行移植手术以重建结膜。其中4例为无眼球结膜囊狭窄，2例为眼球萎缩结膜囊狭窄，1例为大面积结膜肿瘤，2例为眼球粘连，2例为下眼睑基底细胞痛。 结果：在11例中无1例感染，10d后移植的羊膜透明，缝合处结膜向羊膜上爬行，lmo后新牛的结膜上皮完全覆盖移植区，3mo后2例眼球粘连患者重新出现不同程度的睑球粘连，治疗率为91％。 结论：甘油保存人羊膜移植手术可有效重建结膜，但其基本条件为受体眼有一定量的健康球结膜及有血液供应的植床与羊膜植片紧密贴附。     

羊膜联合自体结膜移植的结膜囊成形术

近年来羊膜用于眼表的修复和重建已被国内外研究一致认同,我科采用羊膜联合自体结膜移植治疗险球粘连,并进行长期随访,现报告如下。     

羊膜、结膜及Tenon's膜移植在兔结膜重建中的实验研究

目的比较羊膜移植(amniotic membrane transplantation,AMT)、自体结膜移植(autologous conjunctival transplantation,ACT)、自体Tenon's膜移植(autologous Tenon's fasiatransplantation,ATFT)在结膜重建中的作用.方法新西兰大白兔24只随机分组:对照8眼不作任何处理,滴bFGF眼药水8眼;AMT组16眼,ACT组8眼,ATFT组8眼.于第2,3,4,6周时杀死兔各2只,HE及透射电镜观察.结果AMT组3w时结膜上皮移行至羊膜表面,6w时再生上皮的超微结构接近正常,但杯状细胞较正常少.ACT组从一开始就保持了上皮的完整性且杯状细胞丰富.ATFT组上皮再生与AMT组接近但有轻度结膜下纤维化.结论AMT可有效地修复结膜表面,抑制炎症和瘢痕化.ATFT可改善眼表的基质和血供.ACT是修复结膜缺损的最有效方法.     

自体结膜角膜缘上皮移植术及保存人羊膜移植术治疗翼状胬肉疗效分析

翼状胬肉 (以下简称胬肉 )是眼科常见病、多发病 ,复发率高达 2 0 %～ 70 % [1] 。为探讨复发率低的手术方法 ,我院自 1996年～ 1999年 8月 ,对 12 0例 133眼胬肉随机分为 3组 ,采用胬肉切除联合自体结膜角膜缘上皮移植及胬肉切除联合保存人羊膜移植以及单纯胬肉切除术。术后追踪观察 6月至 3年。现将 3种手术的疗效作一比较 ,报告如下 :临床资料 :12 0例 133眼 ,男 68例 77眼 ,女 5 2例 5 6眼 ,年龄2 4～ 78岁。原发性胬肉 111例 12 4眼 ,复发性胬肉 9例 9眼。Ⅰ组40例 46眼 ,其中复发性胬肉 5例 5眼 ;Ⅱ组 40例 45眼 ,其中复发性胬肉 4例 …     

羊膜移植修复碱烧伤后结膜缺损的实验研究

目的 对羊膜移植修复碱烧伤后结膜缺损的作用机制进行研究。方法 建立碱烧伤结膜缺损动物模型。对实验组进行羊膜移植，观察羊膜生长情况，并于术后3、5、7、14、21d取活体组织进行组织学检查，结果 术后1周羊膜植片颜色接近正常结膜，组织学检查证实羊膜与创伤处结缔组织紧密结合，结膜上皮沿缝合处爬行至羊膜表面，羊膜上仅有轻微的纤维增生，无瘢痕组织形成。结论 保存人羊膜移植能有效地促进碱烧伤后结膜上皮化的进行，减少瘢痕形成，最终减少并发症的产生。     

脱细胞羊膜在结膜囊成形术中的研究与应用

目的研究脱细胞羊膜组织补片在结膜囊成形术中的临床效果。方法对46例（46眼）羟基磷灰石义眼台植入术后结膜囊狭窄进行结膜囊成形术。随访观察6—18月,平均11月。结果16例均获得良好效果。3月后组织补片呈正常结膜色泽外观,且稳定。无感染、坏死及排异等发生。配戴义眼片后患眼外形满意。结论采用脱细胞羊膜组织补片进行结膜囊成形术,取材方便、手术安全、疗效可靠。     

Effect of amniotic membrane transplantation on rabbit conjunctival surface reconstruction at the recovering stage of alkali burn

AIM: To investigate the effect of amniotic membrane transplantation(AMT) on rabbit conjunctival surface recon- struction with severe alkali burns.(2) To evaluate the possibility of AMT treatment for ocular alkali burns during recovering stage. METHODS: Animal models were established on 30 eyes of rabbits by creating severe alkali burns on the conjunctiva from the upper corneal limbus to the upper conjunctival fornix. Preserved human amniotic membrane transplantations and reconstruction of conjunctival fornix were performed at one week after injury (recovering stage). Epithelium growth of burned area after transplantation was observed using light microscope at 1, 2, 3, 4, and 8 weeks. Conjunctival tissue in transplantation area was collected at 1, 4 and 8 weeks. The ultrastructure of the collected tissue was studied by electron microscope. The results were compared with control group, which received only vitamin C subconjunctival injection and antibiotic eye drops as treatment for alkali burn. Exterior eye pictures were also taken at the end of the observation, the width from upper corneal limbus to the edge of upper fornix was measured. Data were analyzed statistically. · RESULTS:(1) In the transplant group, conjunctival epithelium growth was observed in the area of AMT under both light and electron microscope 1 week after surgery. At the 4th week, conjunctival epithelium with goblet cells that resembled normal conjunctival tissues was observed in the whole amniotic membrane area. At the 12th week, the conjunctival epithelium on the amniotic membrane was well formed, and the connective tissue under the epithelium was loose at the fornix. No fibrosis was identified. In contrast, conjunctival epithelium necrosis was observed in the control group at 2 weeks after alkali burns. Reepithelization did not occur through the 12-week observation. Severe fibrosis with inflammatory cells infiltration was observed between 4 to 8 weeks. At the 12th week, fibrosis of the connective tissue at the fornix developed and there were no conjunctival epithelium covering the burned area.(2) In the transplant group, the conjunctiva in transplanted area had no scarring and appeared smooth at the 12th week. Upper fornix was reconstructed. The depth of fornix was 7.9±0.3mm (7.6- 8.2mm), which was approximate to the normal depth 8.2±0.2mm (8.0-8.4mm, P >0.05). While in the control group, the burned area appeared rough with granuloma formation and severe scarring. Upper fornix became shallow. The depth of fornix was 3.1±1.7mm (1.0 - 4.5mm.), and significant difference was found between control and transplant group (P <0.01). CONCLUSION: Human amniotic membrane preserved in glycerin can promote cell adhering, migrating and differenti- ating of normal conjunctival epithelium. Reconstruction of conjunctival surface in early stage of alkali burn can be achieved by AMT. AMT can effectively prevent symblepharon formation.     

羊膜对兔眼滤过道成纤维细胞活性的抑制作用

目的:应用细胞增殖指标核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs),研究兔眼滤过道成纤维细胞(Fb)增殖规律及羊膜的抗增殖作用,并对其临床意义进行探讨。方法:模仿人眼滤过手术方式行兔眼巩膜瓣下巩膜咬切术,切开前房前巩膜瓣下植入5mm×6mm大小的羊膜,术后1,2,3,4wk取兔眼滤过道标本,作AgNORs及HE染色,比较羊膜眼和对照眼FbAgNORs染色颗粒数量、眼压、滤过泡变化。结果:不同手术区羊膜眼FbAgNORs颗粒数显著低于对照眼,羊膜抑制率为10.8%～59.5%,羊膜眼眼压低于对照眼,术后3,4wk差异有显著性;羊膜眼滤过泡保持时间1～4wk,对照眼为1～2wk。结论:羊膜可以有效抑制滤过道Fb的增殖活性、延长眼压下降和滤过泡保留时间。     

翼状胬肉切除联合Ologen胶原基质植入与自体结膜瓣移植术的疗效及安全性

目的：分析翼状胬肉切除联合Ologen胶原基质植入与翼状胬肉切除联合自体结膜瓣移植术后的疗效及安全性。

方法：选取我院2017-01/2020-01收治的翼状胬肉患者80例87眼,随机分为观察组(40例44眼,接受翼状胬肉切除联合Ologen胶原基质植入术)与对照组(40例43眼,接受翼状胬肉切除联合自体结膜瓣移植术)。随访至术后12mo,比较两组患者最佳矫正视力、角膜散光度、表面不对称指数(SAI)、表面规则指数(SRI)、角膜上皮愈合、翼状胬肉复发及并发症发生情况。

结果：两组术后6、12mo时视力变化情况均无差异(P>0.05); 两组术后1、3mo时角膜散光度、SAI、SRI较术前均显著下降,观察组术后3mo时角膜散光度及术后1、3mo时SAI、SRI显著低于对照组(均P<0.05); 观察组术后1wk时角膜上皮愈合率显著高于对照组(73% vs 46%,P<0.05),至术后2wk两组角膜上皮均愈合; 两组术后12mo内未见翼状胬肉复发,术后6、12mo时翼状胬肉复发情况均无差异(P>0.05); 两组术后并发症发生率无差异(7% vs 14%,P>0.05)。

结论：翼状胬肉切除联合Ologen胶原基质植入与翼状胬肉切除联合自体结膜瓣移植术治疗翼状胬肉均可获得可靠的疗效,且安全性相当,但前者在改善角膜散光度、角膜创面规则形态上优势更显著,更利于角膜创面恢复规则形态。     

羊膜移植术在碱烧伤急性期重建结膜表面的实验研究

目的:(1)研究羊膜移植在治疗兔眼大面积结膜碱烧伤,重建健康结膜表面中的作用.(2)探讨碱烧伤急性期施行羊膜移植术的可行性.方法:选用30只家兔,制作角膜缘上方球结膜至穹隆部的碱烧伤的动物模型.实验组于碱烧伤后1wk时(急性期)行保存的人羊膜移植术及穹隆成形术.术后1,2,3,4,8,12wk时做光镜观察移植部位的结膜上皮生长情况,并于术后1,4,8wk时取移植区结膜做电镜观察其超微结构,同时与碱烧伤后行结膜下注射维生素C及应用抗生素眼药水点眼治疗的对照组结膜作对照观察.并在上述相应时期摄眼外观像、做上角膜缘至上方穹隆部宽度的测量.结果:(1)羊膜移植术后1wk时,光镜、电镜可见羊膜上有结膜上皮细胞长入,4wk时,含有杯状细胞的结膜上皮完全覆盖羊膜,接近于正常的结膜组织,12wk时,羊膜上结膜上皮细胞排列整齐,穹隆部结膜上皮下纤维结缔组织较为疏松,无增生.而对照组1wk时见结膜上皮细胞坏死脱落,未见有含杯状细胞的结膜上皮长入,4～8 wk时所见为大量纤维结缔组织增生,伴炎性细胞浸润.12wk时,穹隆部纤维结缔组织增生明显,未见有正常结膜上皮覆盖.(2)外观眼表可见,12wk时实验组移植区结膜光滑无瘢痕,上穹隆形成良好,穹隆深达7.6～8.2 mm,接近正常穹隆深度8.0～8.5 mm.而对照组结膜表面不光滑,有结膜肉芽肿形成,瘢痕增生明显,上方穹隆明显变浅,穹隆深度为1.0～4.5 mm.结论:以甘油保存的羊膜可作为一种底物载体,提供健康的基底膜,有利于周围正常结膜上皮的粘附、移行和分化,进而重建正常结膜表面.结膜碱烧伤后早期行羊膜移植可重建正常结膜表面,有效地防止睑球粘连的发生.     

羊膜为基底的小片状同种异体结膜移植治疗碱烧伤

目的 将羊膜移植与片状同种异体结膜移植相结合重建眼表。方法 新西兰白兔42只，右眼(实验组)、左眼(对照组)上方球结膜碱烧伤后24h分别行以羊膜为基底的小片状同种异体结膜移植和单纯小片状同种异体结膜移植，术后各周行印迹细胞的PAS染色、扫描电镜检查。结果 实验组植片成活率明显高于对照组(P＜0．05)。实验组术后第4周，对照组术后第5周结膜外观、杯状细胞形态数目功能均恢复正常。结论 大面积结膜碱烧伤早期应用羊膜改善异体植片的基底，有利于降低排斥反应，提高植片成活率，达到结膜结构与功能重建之目的。     

自制细胞外基质胶泪道羊膜生物学特性及修复泪道损伤的实验研究

目的　研究自制细胞外基质胶泪道羊膜的生物活性因子表达含量、生物力学特征以及在修复兔泪道损伤中的应用效果。方法　使用放射免疫分析方法对自制细胞外基质胶泪道羊膜中表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＥＧＦ）、成纤维细胞生长因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＦＧＦ）、肝细胞生长因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＨＧＦ）等１０种生物活性因子的表达含量进行测定,并与新鲜泪道羊膜、干燥泪道羊膜进行对比。利用负荷传感器对比自制细胞外基质胶羊膜与新鲜泪道羊膜、干燥泪道羊膜的抗拉强度、断裂伸长率和弹性模力,且把保存１２个月的自制细胞外基质胶泪道羊膜应用于修复兔泪道损伤模型,并于术后４周观察兔泪道黏膜修复及Ｋ１６表达情况。结果　自制细胞外基质胶泪道羊膜、干燥泪道羊膜中１０种细胞因子含量均比新鲜泪道羊膜低（均为Ｐ＜０．０５）,而ＥＣＭ泪道羊膜中１０种细胞因子含量均明显高于干燥泪道羊膜（均为Ｐ＜０．０５）。自制细胞外基质胶泪道羊膜的抗拉强度和断裂伸长率与新鲜泪道羊膜、干燥泪道羊膜相比明显增加（均为Ｐ＜０．０５）,而自制细胞外基质胶泪道羊膜的弹性模量明显小于新鲜泪道羊膜及干燥泪道羊膜（均为Ｐ＜０．０５）。术后４周发现ＥＣＭ-ＬＤＡＭ组泪道管口通畅,无明显的排斥反应和炎症反应,其下睑泪道黏膜Ｋ１６表达阴性,而对照组泪道黏膜Ｋ１６表达阳性。结论　自制细胞外基质胶泪道羊膜含有丰富的生物活性因子和优越的生物力学特性,是一种更加安全有效的泪道修复及重建材料。