腭板培养及其在发育毒性研究中的应用

腭板培养是常用的器官培养方法之一。该方法具有快速、简便、经济、观察终点明确等优点。本文就腭板增减的方法、结果评价及其在发育毒性研究中的应用进行系统的阐述。     

过量全反式视黄酸对腭突中嵴上皮细胞迁移的影响

目的通过细胞划痕实验观察过量全反式视黄酸(all-trans retinic acid,atRA)对原代腭突中嵴上皮细胞迁移的影响。方法以10 w龄昆明小鼠按雌雄比例2:1合笼,得到妊娠13 d孕鼠。将1只妊娠13 d孕鼠处死,分离得到全部胎鼠腭突,以中性蛋白酶分离腭突中嵴上皮,继以胰酶消化,用DMEM/F-12培养基调整细胞浓度后接种于培养瓶中,CO2培养箱中培养96 h。取同等细胞浓度接种于6孔板中,同样条件下培养24 h。弃去原培养基,在各孔贴壁细胞层划出一条划痕带,分别加入相应培养基后得到3孔5μmol/L atRA实验组和3孔对照组,继续原条件培养72 h。结果:原代腭突中嵴上皮细胞贴壁生长,多角形或卵圆形,成片生长;当细胞融合率>80%,呈现铺路石状外观。在培养过程中,对照组划痕逐渐弥合,培养72 h,爬行细胞几乎覆盖整个划痕带;而atRA实验组未见到向划痕区迁移的细胞,划痕宽度没有改变。结论:过量atRA可抑制腭突中嵴上皮细胞发生迁移。     

视黄酸阻滞胎鼠腭间质细胞周期进程并诱导凋亡

目的探讨全反式视黄酸(atRA)对小鼠胚胎腭间质细胞(MEPM)细胞增殖和细胞周期的影响及其分子生物学作用机制。方法MEPM细胞取材于孕13d胎鼠腭组织。MTT比色法检测atRA对MEPM细胞增殖活力的影响;流式细胞术分析atRA对细胞周期分布的影响,并同时观察有无细胞凋亡现象发生;Western-blot检测atRA对细胞周期蛋白D和E表达的影响,并观察对视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化的影响。结果与溶剂对照组相比,在5~10μmol/L浓度范围内,atRA能够显著性抑制MEPM细胞增殖活力(P<0.05),并将细胞周期滞留在G0/G1期(P<0.05)。atRA对细胞周期蛋白D和E的表达及相应酶活性均表现为抑制效应。观察Rb的变化也显示,atRA降低Rb的磷酸化作用。结论atRA对腭器官发育敏感期腭间质细胞增殖活力及细胞周期的抑制作用可能是atRA诱导诱导唇腭裂的机制之一。     

鼻中隔转移腭板成形术在上颌骨全切除后的应用

自１９８７年起，我院对１２例中、晚期上颌窦或腭部癌瘤（Ｔ２２例，Ｔ３７ ，Ｔ４３例）患者施行上颌骨全切后，采用鼻中隔转移腭板成形修复腭部缺损，获得满意效果。此法较符合口、鼻腔功能的生理要求，提高患者生存质量，值得推广。本文就其临床价值，适应症选择、手术操作及治疗效果等进行探讨。     

视黄酸对脐血树突状细胞的作用及其途径

目的:研究视黄酸(RA)对脐血树突状细胞(dendriticcell,DC)分化、成熟和功能的影响,探讨视黄酸受体(retinoicacidreceptorα,RARα)在RA对脐血DC调节中的作用。方法:收集脐血9份,分离单个核细胞后,均匀分为4组:对照组、RA组、RARα特异性拮抗剂组(RO组)、RA+RO组。在体外进行DC的诱导培养,流式细胞仪检测细胞表面标记及其荧光强度,观察RA及RARα对DC分化、成熟的影响;培养DC与T细胞进行混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)后,观察RA及RARα对DC刺激异体T细胞增殖能力的作用;采用ELISA法和RT-PCR法研究RA和RARα在DC对Th细胞极向分化调节中的作用。结果:RA使DC的分化、成熟明显受抑,但当RO同时加入时,则可逆转该影响;MLR后发现RO可逆转RA对T细胞增殖的抑制作用;在DC对T细胞极向分化的研究中,无论在蛋白水平还是基因水平,RO均可明显阻止RA对Th1(IFN-γ)的下调和对Th2(IL-4、IL-10)的上调作用。结论:RA抑制体外培养的脐血单个核细胞向DC的分化和成熟,降低其MLR能力,使免疫反应向Th2方向偏移。RARα从多个环节上参与了RA对脐血DC的调节作用。     

视黄酸对胎鼠腭突融合的影响及其作用机制

目的探讨视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)对胎鼠腭突融合的影响及其作用机制。方法对孕13d胎鼠双侧腭突进行体外培养,HE染色观察atRA对腭突融合的影响;免疫双标记分析atRA对腭突组织细胞凋亡及层粘连蛋白降解的影响;Western blot检测腭突组织中Smad2磷酸化的变化。结果经72h培养,对照组双侧腭突完全融合;5μmol/L atRA实验组双侧腭突可接触但不能融合。共聚焦显微镜显示,双侧腭突接触处层粘连蛋白降解,上皮细胞向口侧和鼻侧三角处迁移,并逐渐凋亡;atRA抑制层粘连蛋白降解,接缝处上皮组织完好,上皮细胞无凋亡发生,间质组织中可观察到细胞凋亡。Western blot图片显示:在腭突融合过程中,Smad2磷酸化增强;相反,atRA实验组未检测到Smad2磷酸化。结论atRA抑制双侧腭突接缝处基底膜降解和上皮细胞向口、咽三角处迁移及凋亡,诱发腭间质组织细胞凋亡,进而抑制双侧腭突融合,其作用机制可能与中嵴上皮细胞中Smad2磷酸化被抑制相关。     

维生素A对小鼠造血微环境影响的研究

目的：　探讨维生素Ａ（ＶＡ）对造血微环境的影响,揭示ＶＡ缺乏影响红系造血的机制。方法：免疫细胞化学（ＳＰ）法检测视黄酸受体（ＲＡＲａ）蛋白,原位杂交技术动态检测原癌基因ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｆｏｓ和粒－单集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ｍ ＲＮＡ 的表达,检测细胞因子生物活性和基质细胞层粘附能力。结果：　（１）全反式视黄酸（ＡＴＲＡ）诱导的小鼠骨髓基质细胞条件培养液（ＢＭＳＣＣＭ）能显著促进红系早期祖细胞（ＢＦＵ－Ｅ）的增殖（Ｐ＜ ０．０１）。（２）ＡＴＲＡ明显促进基质细胞层的粘附能力。（３）ＲＡＲａ 蛋白在实验组和对照组ＢＭＳＣ持续表达,ＡＴＲＡ对其表达水平无影响。（４）实验组ＢＭＳＣ与对照组相比ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ ｍ ＲＮＡ的表达水平在３０ｍ ｉｎ 即有显著性差异（Ｐ＜ ０．０１）,持续表达至６０ｍ ｉｎ,１２０ｍ ｉｎ 降至对照组水平。实验组ＧＭ－ＣＳＦｍ ＲＮＡ的表达在３０ｍ ｉｎ,６０ｍ ｉｎ 与对照组水平相比无显著性差别,直至１２０ｍ ｉｎ 才表现出显著性差异（Ｐ＜ ０．０１）。结论：　ＶＡ促进小鼠ＢＭＳＣ分泌造血细胞生长因子并增强其粘附能力,通过调节ＢＭＳＣ中ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｆｏｓ的信号传导通路调节ＢＭＳＣ分泌ＧＭ－Ｃ     

全反式视黄酸对小鼠胚胎发育毒性的体外实验研究

目的为研究全反式视黄酸（atRA）的发育毒性及其可能的作用机制，本研究采用植入后体外全胚胎培养方法研究atRA对小鼠胚胎生长发育的影响。方法孕8．5日龄小鼠胚胎移植于atRA终浓度为0、0．01、0．1、0．2、0．4、1．0、10．0μmol／L的全胚胎培养基中，体外连续培养48h，观察atRA对胚胎发育和器官形态分化的影响。结果atRA可影响小鼠胚胎在体外的生长发育，并呈现剂量-效应关系；0．1μmol／L组，atRA明显影响卵黄囊直径、颅臀长、前脑、中脑、听觉系统、视觉系统、心脏、体位和前肢芽等指标，与对照组比较，差异有显著性（P〈0．05）；≥0．20μmol／L组，卵黄囊体积减小、表面皱缩、血管减少及分化程度降低，神经系统、心脏、腮弓和颅面等多种器官出现畸形，所有器官形态分化指标均显著低于对照组（P〈0．05）。结论atRA有致畸性和胚胎毒性，在器官形成期可以引起神经系统、心脏、腮弓和颅面等多种器官的发育畸形。     

视黄酸对小鼠骨髓干/祖细胞向粒系分化作用的研究

用全反式视黄酸（ＡＴＲＡ） 和视黄醇（ｒｅｔｉｎｏｌ） 给小鼠灌胃给药后,观察小鼠骨髓细胞的增殖分化状况以及对干／ 祖细胞向粒系分化的影响。结果显示：与正常对照组比较,ＡＴＲＡ 或ｒｅｔｉｎｏｌ 均可刺激骨髓细胞增殖（ｐ ＜ ０ ．０５） ,并诱导干／ 祖细胞向粒系分化和粒系的终末分化;ＡＴＲＡ 作用优于ｒｅｔｉｎｏｌ,且呈时间剂量依赖性增加反应关系（ｐ ＜ ０ ．０５） 。提示正常机体摄入视黄醇类化合物后可诱导骨髓／ 祖干细胞向粒系分化     

全反式视黄酸诱发胎鼠腭裂及抑制Smad2磷酸化的作用

目的观察过量全反式视黄酸(atRA)对胎鼠腭发育的影响及其对Smad2磷酸化的调节作用。方法将ICR孕鼠随机分为atRA实验组和溶剂对照组,在11天(查见阴栓为孕0天),分别灌胃给予80mg/(kg·d)atRA或等体积的玉米油溶剂。常规HE组织学染色观察胎鼠上腭发育情况;免疫组化和Western Blot检测突中嵴上皮内pSmad2的表达。结果80mg/(kg·d)atRA可导致90%胎鼠发生腭裂;在腭突融合过程中,中嵴上皮细胞内Smad2被内源性的激活,出现明显磷酸化,在80mg/(kg·d)atRA组,可检测到总Smad,但是不能检测到磷酸化pSmad2的表达。结论孕期过量atRA可导致胎鼠发生腭裂,其致畸作用机制可能与中嵴上皮细胞内Smad2磷酸化被抑制有关。     

小鼠胚胎肢体器官培养模型的建立

为建立一套能简便、客观研究单因素对骨形成影响的方法 ,应用自制浸没式一次通气旋转装置对孕龄 16天的小鼠肢体器官进行体外培养 ,采用X ray摄片及组织学切片技术分析骨发育情况。结果显示 ,经过 6天培养后 ,骨密度增加 ,骨组织呈活跃增殖 ,分化相 ,骨小梁增多 ,成骨区明显。提示胚胎肢体器官能在体外培养中存活并继续生长、发育 ,证明本模型成功     

sHsps在小鼠正常腭发育和腭裂发生过程中的表达

目的　研究sHsps在正常腭发育及腭裂发生过程中的表达情况。方法　在GD10经口一次分别给予实验组孕小鼠80mg kg的视黄酸(RA)、对照组孕鼠等体积的植物油,并分别于GD15 GD17取两组胎鼠的腭,利用RT- PCR方法半定量检测实验和对照组中sHsps的表达丰度。结果　正常腭除Hspb10在GD17不表达外,其余Hsps基因在GD15 - GD17均有明显表达,Hsp2 0、Hsp2 5、Hsp2 7、Hsp32、Hspb2、Hspb3、Hspb7表达丰度基本恒定,Hsp30、Hspb5随胚龄的增加而表达丰度增高,Hsp10、Hsp2 2、Hspb4、Hspb9在GD16出现表达高峰。Hsp30、Hsp32、Hspb4、Hspb10在GD15 - GD17的表达丰度腭裂组明显高于正常组。Hsp10、Hsp6 0、Hspb5、Hspb9在GD15 - GD17的表达丰度腭裂组明显低于正常组。Hspb9、Hspb10在正常腭发育和腭裂发生过程中的表达模式明显不同。结论　15种Hsps除Hspb10在GD17不表达外,其余在GD15 - GD17正常腭发育过程中均有明显表达,但不同Hsps的表达特点有所不同;Hsp30、Hsp32、Hspb4、Hspb10在腭裂发生中可能主要起应激保护反应,Hsp10、Hsp6 0、Hspb5、Hspb9、Hspb10可能与腭裂的发生有关。     

用小鼠胚胎肢体器官培养研究锌对骨发育的影响

用自制浸浴式一次通气旋转装置对孕龄 16d小鼠胚胎前肢进行培养 ,采用组织学分析及检测骨组织中AKP活性的方法研究锌对骨发育的影响。结果表明 ,与对照组相比 ,锌缺乏组和过量补锌组 (终浓度含锌 12 0 μmol L)的骨组织发育延迟 ,骨组织中AKP活力降低 ;而适量补锌组 (终浓度含锌 4 5 μmol L及 70 μmol L)则促进成骨细胞向骨细胞增殖、分化 ,增加类骨质的分泌与合成 ,促进类骨质向骨质转化 ,提示适量补锌有潜在促进骨形成的作用     

大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立

目的 建立大鼠体外多器官细胞共培养方法.方法 采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞和真皮成纤维细胞,用锥虫蓝染色法检测细胞分离成活率,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将5种细胞的飞片放入同一培养皿,用体积分数为10%的FBS DMEM培养基培养7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法比较原代细胞在单独培养和共培养时的生长情况.结果 建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,细胞分离成活率均达90%,其中胶原酶消化法培养肝细胞的存活率达90.3%,两步消化法培养肾细胞的细胞存活率达91.9%,心肌细胞的胶原酶消化法细胞存活率达93.0%.3～15 d的心肌细胞搏动频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),差速贴壁法培养的肺泡巨噬细胞存活率可达90.8%,以胶原酶消化法培养的原代真皮细胞存活率达92.7%,细胞生长状态良好.5种原代细胞的多器官细胞共培养结果显示,共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合.结论 所建立的大鼠多器官细胞共培养方法是成功的.     

白血病小鼠模型的建立与应用现状

小鼠是白血病研究中最重要的动物模型,本文主要综述了白血病小鼠模型的建模方法和研究进展,以及白血病小鼠模型在医学领域中的应用。     

小鼠腔前卵泡体外培养方法的建立

目的建立可供毒理学研究的小鼠腔前卵泡体外培养方法。方法采用机械方法分离出生后12～14天(C57B1/6JxCBA/Ca)小鼠卵巢内直径为100～130μm的腔前卵泡,96孔板单个卵泡连续培养12天后诱导排卵16h,观察卵泡发育、激素分泌和卵子形成,并将体外卵母细胞的成熟情况(IVG)与体内卵母细胞的生长情况(IVM)进行比较,以判断体外培养方法是否成功。结果分离完整卵泡率为89.74%(376/419);培养12天卵泡存活率为96.81%(364/376),有腔形成率为48.94%(184/376);卵泡和卵母细胞直径显著增加。诱导排卵后卵丘细胞-卵母细胞复合体排出率为56.38%(212/376);培养卵泡经历从腔前卵泡到卵母细胞成熟和极体排出的形态学变化,也有部分卵泡不发生腔样结构改变。体外培养卵泡分泌E2和P激素与体内分泌特征一致。IVG组4.61%(10/217)卵母细胞不能恢复成熟[停止在生发泡期(GV期)],76.50%(166/217)停止减数分裂在生发泡破裂期(GVBD期),18.89%(41/217)卵母细胞停止在第2次减数分裂(MII期)(PB);而IVM组1.24%(3/241)的卵母细胞不能恢复成熟(停止在GV期),45.23%(109/241)停止减数分裂在GVBD,53.53%(41/241)卵母细胞停止在MII期(PB);卵母细胞染色体核型完整,无染色体数目和结构异常。结论本研究建立的小鼠腔前卵泡体外培养方法基本成功,可作为卵泡发育生理研究和毒理学研究的模型。     

人子宫内膜异位症裸鼠模型的建立及应用

子宫内膜异位症(EMs)是育龄女性常见病,其发病机制不明.人体中很难进行对照研究,限制了EMs的研究进展.目前建立EMs裸鼠模型主要方法为将在位或异位人子宫内膜组织移植到裸鼠体内生长,可保持移植物原有形态和生化活性,在此模型上对EMs病因、发展及治疗等进行研究.对不同方法建立裸鼠EMs动物模型观察病灶形态学、组织黏附、增殖、激素反应及用此模型研究基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂、血管内皮生成因子(VEGF)抑制剂、芳香化酶抑制剂、肿瘤坏死因子d(TNF-α)抑制剂对EMs病灶的作用作一综述.     

肠道病毒71型快速培养鉴定方法的建立和应用

目的:建立肠道病毒71型(EV71)快速培养鉴定方法,并应用于EV71感染的早期诊断。方法:1.以不同滴度的EV71临床分离株,低速离心接种于人横纹肌肉瘤细胞(RD)96孔板内,设定时间梯度培养后用间接免疫荧光技术检测EV71早期抗原,以优化快速培养鉴定方法的条件。2.采集上海地区2010年手足口病例患者的咽拭子、大便标本50份,以EV71快速培养鉴定方法检测,并与病毒分离培养比较。结果:病毒滴度为106TCID50/0.1 ml的EV71临床分离株系列稀释后培养3 d,至最高稀释度10-10能100%检测到病毒抗原。检测咽拭子标本5份、大便标本45份,病毒分离检测阳性26份,出现CPE平均时间为9.8d±2.098,阳性率为52.0%;快速培养鉴定方法3 d检出阳性30份,阳性率为60.0%。结论:在96孔板上开展离心培养结合免疫荧光技术应用于EV71感染的早期诊断,缩短了病原体检出时间、敏感性高、特异性强,操作更为简便,是快速诊断EV71感染的可靠方法。     

胎儿唇腭裂产前诊断及预后研究现状

唇腭裂是最常见的颜面部畸形,对于该病的病因迄今尚未阐明,目前多认为该病是由于遗传、环境因素共同作用所致。中孕期通过超声、MRI等辅助检查方法可诊断胎儿唇腭裂。部分胎儿唇腭裂合并其他畸形,部分存在基因、染色体异常,影响患儿出生后生存质量及预后等,因此产前对胎儿唇腭裂的明确诊断至关重要。胎儿唇腭裂宫内手术治疗目前尚处于研究阶段,非综合征性唇腭裂(NSCL/P)患儿于婴幼儿期进行手术治疗后,多数可以康复。笔者拟就胎儿唇腭裂产前诊断及预后研究现状进行阐述,以提高临床对该病的诊治水平。     

孕期服用叶酸预防和阻止小鼠腭裂的初步研究

目的:探讨叶酸对地塞米松所诱导小鼠腭裂的预防和阻止作用,为唇腭裂的预防提供新的途径。方法:选取NIH系小鼠,分为5组,第1组孕鼠在GD1-15经口灌胃0·6ml的生理盐水,第2、3、4组在GD1-15分别经口灌胃10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg的叶酸;第5组在GD13-18经口灌胃60mg/kg的叶酸。5组孕鼠均在GD12腹腔注射50mg/kg醋酸地塞米松。在GD18断颈处死孕鼠,剖腹检查胎鼠吸收和死亡情况,对活的胎鼠检查腭裂发生情况。结果:第1组未用叶酸处理的孕鼠所产胎鼠腭裂的发生率为63·8%;第2组腭裂的发生率为64·9%;第3组腭裂的发生率为58·9%;第4组腭裂发生率为42·3%;第5组腭裂的发生率为65·3%。统计学分析第4组与第1组之间差异有显著性;第2、3、5组与第1组之间差异无统计学意义。结论:只有高剂量的叶酸(60mg/kg)才能降低胎鼠腭裂的发生率;并且要从妊娠的前期开始连续使用,才能达到良好的预防效果。