高剪切场诱导血小板活化和聚集机制的研究进展

剪切诱导血小板聚集(shear-induced platelet aggregation,SIPA)是动脉血栓的重要成因。在高剪切流场下血小板由膜表面膜糖蛋白(GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ和GP Ⅱb／Ⅲa)与血浆中的von Willebrand因子(vWF)介导发生活化、黏附和聚集。但在低剪切流场却观察不到这种现象,因而SIPA现象是生化因素和力学因素的耦合作用的结果。作者以介导血小板聚集的蛋白质分子为线索综述了近年来有关SIPA机制的研究成果,并提出从力学环境与生化反应的耦合关系入手研究SIPA现象触发机制是今后值得深入的研究方向。     

流场中 vWF-A1 介导的血小板表面 CD40L 表达

目的 揭示流场中 vWF-A1 介导血小板表面 CD40L 表达的力学调控机制。 方法 选用原核系统表达蛋白、流式细胞仪、平行平板流动腔技术与细胞免疫荧光抗体染色技术,探究在不同剪切力环境中血小板由 vWF-A1 诱导活化和随后表达 CD40L 的过程。 结果 vWF-A1 在静息条件下不会激活血小板;流体剪切力( fluid shear stress,FSS)是 vWF-A1 介导的血小板 CD40L 表达的启动开关;随着剪切应力累积(shear stress accumulation, SSA)的增加,血小板 CD40L 的表达水平呈现先上升后下降的趋势,当 SSA 达到 2 Pa·min 时,血小板 CD40L 表达量达到峰值。结论 vWF-A1、FSS 和 SSA 调控血小板表面 CD40L 的表达,SSA 促进了血小板表达 CD40L 的能力。     

血管性血友病因子裂解酶金属蛋白酶域的克隆和表达

目的:克隆和表达血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)的金属蛋白酶域。方法:应用PCR从含有人vWF-cp金属蛋白酶域的质粒中扩增出该区域,克隆至pUC18载体后行序列分析,并将其重组于带有6×HisTag的融合蛋白表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌DE3／plySs中诱导表达。融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,采用Westernblot印迹鉴定。结果:PCR扩增得到658bp的vWF-cp金属蛋白酶域的基因片段,测序结果与GenBank序列一致。重组表达质粒经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导5h后表达的融合蛋白占菌体总蛋白的28％,进一步纯化后其纯度在95％以上。结论:在大肠杆菌中高效表达了人vWF-cp的金属蛋白酶结构域,为深入研究vWF-cp结构与功能的关系奠定了基础。     

中药脑血宝制剂对凝血和血小板聚集率的影响

目的和方法:本研究在体内、体外实验的基础上,通过测定血浆中活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、抗凝血酶III(AT-Ⅲ)活性、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fng)、纤溶酶原(Plg)的变化以及血浆中血小板聚集率来观察脑血宝制剂对血液凝固过程不同阶段和血小板聚集率的影响,分析其抗血栓作用的机制。结果:脑血宝预防组,血浆中APTT、PT均比血栓组延长(P＜0.05,P＜0.01),AT-Ⅲ的活性高于血栓组(P＜0.05,P＜0.01),Fng含量低于血栓组,TT延长,Fng和TT呈负性相关关系,血小板聚集率明显低于血栓组(P＜0.05,P＜0.01)。结论:脑血宝制剂对凝血的多个环节均有抑制作用,从而对抗血栓的形成。     

急性呼吸窘迫综合征患者血液中von Willebrand因子含量的变化

目的：观察21例急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）患者发病早期血液中血管性假血友病因子（von Willebrand factor, vWF）含量的变化，考察其对ARDS早期诊断价值。方法：21例ARDS患者第1 d，30例急性左心衰竭、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）肺部感染患者及正常对照同期抽血测vWF。结果：ARDS患者血vWF为325%±63%，急性左心衰竭患者血vWF为107%±42%，COPD肺部感染患者血vWF为103%±48%，正常对照者为92%±36%。ARDS组明显高于各对照组（P<0.01）。结论：ARDS患者在发病早期血vWF即明显升高，提示血vWF含量对ARDS的早期诊断有参考价值。     

大蒜素与盐酸川芎嗪对剪切诱导血小板聚集的抑制作用

目的研究大蒜素与盐酸川芎嗪对剪切诱导的血小板聚集（ＳＩＰＡ）的抑制作用及其规律。方法采集家兔血液,并用柠檬酸钠抗凝。用常规离心法制备富血小板血浆（ＰＲＰ）及贫血小板血浆（ＰＰＰ）。所研究的药物在室温（２２～２５℃）下与浓度为３×１０~５／μｌ的ＰＲＰ温育５ｍｉｎ。采用备有激光源和光传感器的剪切装置,以 ２０,４０ ａｎｄ ５２ ｄｙｎｅｓ／ｃｍ~２剪切 ＰＲＰ １２０ｓ。最大ＳＩＰＡ由仪器的计算机给出。结果川芎嗪对ＳＩＰＡ的半抑制浓度（ＩＣ_（５０））在 ２０,４０ａｎｄ ５２ ｄｙｎｅｓ／ｃｍ~２下分别为 ０．２２,０．２８和０．５２ｍＭ。本研究首次报道了大蒜素对剪切诱导血小板聚集的抑制作用,在 ２０,４０ａｎｄ ５２ ｄｙｎｅｓ／ｃｍ~２下 ＩＣ_（５０）分别为 ０． １３,０． ５１和 １．２７ｍＭ。在ＩＣ_（５０）和剪应力τ之间存在指数相关： ＩＣ_（５０）＝ａｅ~（ｂτ）。对于大蒜素,ａ与ｂ分别为０．０３１和０．０７１,对于川芎嗪ａ与ｂ分别为０．１２３和０．０２５。结论川芎嗪搞ＳＩＰＡ作用优于大蒜素。     

富血小板血浆中血小板浓度对血小板聚集的影响

目的探讨富血小板血浆（PRP）血小板浓度对血小板聚集的影响。方法随机收集107名门诊体检健康志愿者静脉血浆,分离PRP和PPP（贫血小板血浆）后,用血液分析仪测定PRP血小板浓度,按PRP浓度用自身PPP配成50×109/L～400×109/L浓度梯度的血浆,用血浆比浊法测血小板聚集率。结果 PRP血小板浓度在50×109/L～400×109/L,二磷酸腺苷（ADP）和花生四烯酸（AA）诱导的血小板聚集率分别为（10.4±8.7）%至（55.3±9.9）%和0%至（75.2±10.1）%,血小板聚集率随血小板浓度的增高而增高,血小板浓度为250×109/L时,聚集率增幅减缓,血小板浓度小于150×109/L时,血小板聚集率明显降低。结论 PRP血小板浓度对血小板聚集的影响明显,血小板聚集试验PRP血小板浓度大于150×109/L;血浆比浊法血小板聚集试验适宜的血小板浓度为250×109/L。     

血管生成素4对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

 目的：观察血管生成素4（Ang-4）对脂多糖(LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：EnVision法免疫组化鉴定HUVECs。LPS诱导细胞损伤,不同剂量的Ang-4干预。显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测von Willebrand因子（vWF）和肿瘤坏死因子（TNF-α）含量,real-time PCR检测Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB） p65和TNF-α mRNA含量变化。结果：免疫组化示胞浆内人Ⅷ因子相关抗原呈阳性;与正常组比,LPS组细胞增殖活力降低（P<0.01）,vWF及TNF-α分泌增多(P<0.01),且TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表达升高(P<0.01);Ang-4（100 μg/L）组可恢复细胞活力,降低vWF及TNF-α含量(P<0.01),抑制LPS所致TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA的表达(P<0.01)。结论：Ang-4可拮抗LPS诱导的HUVECs损伤,这可能与抑制TLR4-NF-κB p65-TNF-α信号通路的活化有关。     

2型糖尿病患者血清von Willebrand因子变化与微血管并发症的关系

目的 :探讨 2型糖尿病患者的微血管内皮细胞功能损伤与微血管并发症之间的关系。方法 :从 3 3 4名 2型糖尿病患者中选择合并微血管并发症但未合并大血管并发症者 3 2人作为微血管并发症组 ,并选择年龄与之匹配的无大血管及微血管并发症 55人作为无并发症组 ,观察二组患者血清vonWillebrand因子 (vWF)水平 ,并与年龄相接近的正常对照组 ( 4 0例 )比较。结果 :血清vWF水平正常对照组 0 .92U± 0 .44U/ml;无并发症组 1.15U± 0 .42U /ml ;微血管并发症组 1.3 7U± 0 .44U/ml;三组之间均有显著性差异 (P <0 .0 5～ 0 .0 1)。多因素Logistic回归分析表明vWF、空腹血糖分别与糖尿病人是否合并微血管病变显著相关 (ExpB分别为 3 .0 2 3 ,1.3 3 7,P <0 .0 5～ 0 .0 1) ,以vWF为应变量的多元逐步回归分析表明年龄、糖尿病病程、甘油三酯分别与vWF呈显著独立正相关 (B =0 .53 ,0 .3 5,0 .2 9,P <0 .0 5～ 0 .0 1)。结论 :在糖尿病患者中存在不同程度的微血管内皮细胞的损伤 ,此变化随着微血管并发症的进展呈进行性加重。以vWF升高所反映的微血管内皮细胞损伤是一项值得临床推广的研究方法     

vWF-A1A2A3介导的循环血小板的翻滚运动

目的 揭示血流剪应力对vWF-A1A2A3介导的循环血小板翻滚行为的调控机制。方法 利用平行平板流动腔实验技术,在不同流体剪应力条件下,观察和分析血小板在铺有200 μg/mL的 A1A2A3流动腔底板上的翻滚黏附行为,提取细胞滚动特征参数。结果 血小板在底板vWF-A1A2A3上的翻滚速度和时间、停留时间、停留频率和停留时间比率等参数均呈现双相力依赖的特性,剪应力阈值或拐点均发生在0.8 Pa左右;在剪切阈值水平之下,剪应力的增加可降低细胞滚动速度并增加滚动的稳定性。结论 流体壁面剪应力主要通过调节血小板在A1A2A3上的停留时间来影响其翻滚速度,提示相应的力学调节机制与GPIbα/ A1A2A3黏附键从“逆锁键”向“滑移键”的转化过程相关。     

改良墨汁灌注法与von Willebrandfactor免疫荧光法在大鼠视网膜微血管形态显示中的对比研究

目的:比较改良墨汁灌注法与von Willebrand factor(vWf)免疫荧光法在大鼠视网膜微血管形态显示方面的异同.方法:成年健康SD大鼠随机分成vWf免疫荧光显色组和改良墨汁灌注组.改良墨汁灌注组分两步灌注明胶墨汁40 ml.vWf免疫荧光显色组常规灌注生理盐水40 ml.视网膜行铺片和切片,观察vWf免疫荧光法和改良的墨汁灌注法显示的微血管形态;两组视网膜切片还进行NeuN、Parvalbumin和GFAP的免疫组织化学显色.结果:vWf免疫荧光法能充分显示视网膜铺片周嗣部的微血管,但对铺片中央部和切片的微血管显示不良;改良墨汁灌注法能充分显示大鼠视网膜铺片和切片的微血管,用此方法灌注的视网膜切片的NeuN、Parvalbumin和GFAP免疫组织化学效果均与正常视网膜相似.结论:改良墨汁灌注法在大鼠视网膜微血管形态显示中优于vWf免疫荧光法,且能在同一切片上准确显示血管与神经元/胶质细胞的空间关系.     

海带多糖L01抑制血小板活性与血管内皮细胞保护作用

目的： 探讨海带多糖L01抑制血小板活性与保护血管内皮细胞（VEC）的关系。 方法： 采用注射肾上腺素（Adr）法建立大鼠VEC损伤模型，滤过法测定大鼠血小板黏附性，火棉胶玻片法观察血小板表面聚集活性，酶联免疫吸附双抗体夹心（ELISA）法测定大鼠血浆血管性血友病因子（vWF）含量，免疫组化检测主动脉完整内皮长度（μm）。结果： 模型组自造模第3 d起大鼠血小板聚集率、第4 d起血小板黏附率均分别高于生理盐水组(P<0.05，P<0.01)，L01高剂量（50 mg/kg）、低剂量（10 mg/kg）组第4 d和第5 d大鼠的血小板黏附率和聚集率低于模型组 (P<0.05，P<0.01)；造模第4 d，模型组大鼠血浆vWF水平高于生理盐水组(P<0.05);L01高剂量组大鼠血浆vWF水平低于模型组 (P<0.05);造模第5 d，模型组与生理盐水组比较、L01高、低剂量组与模型组比较，均呈现出同样的结果(P<0.05)；造模第4 d和第5 d免疫组化检测主动脉完整内皮长度显示，模型组长度小于生理盐水组，L01高剂量、低剂量组长度明显大于模型组（P<0.05）。 结论： L01抑制血小板活性的作用与保护VEC有关。     

两个3型遗传性血管性血友病家系表型和基因型分析

目的 对2例遗传性血管性血友病家系进行临床表型诊断和基因型分析,探讨其分子发病机制.方法 分别采用出血时间、活化部分凝血活酶时间、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验、血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)瑞斯托霉素辅因子试验、vWF抗原、vWF活性、vWF胶原结合实验和多聚体分析对2例遗传性血管性血友病先证者和家系成员进行表型诊断.抽提先证者外周血基因组DNA,PCR法扩增VWF基因的52个外显子及侧翼序列,通过直接测序分析VWF基因突变.结果 2例先证者出血时间和活化部分凝血活酶时间均延长,血浆瑞斯托霉素诱导的血小板聚集、vWF瑞斯托霉素辅因子活性、vWF抗原、vWF活性、vWF胶原结合功能均显著降低,多聚体分析显示2例先证者多聚体均缺无,先证者A基因分析发现第17外显子的纯合插入突变g.82888_82889insCATG,导致740位蛋氨酸往后编码10个异常氨基酸后终止.先证者B基因分析发现第20外显子g.94865G＞A(Trp856X)和第28外显子g.110698_110699delinsG导致1481位甘氨酸往后编码42个异常氨基酸后终止的复合杂合突变.结论 g.82888_82889insCATG纯合插入突变和g.94865G＞ A(Trp856stop)与g.110698_110699delinsG的复合杂合突变分别导致了2例先证者的3型遗传性血管性血友病.     

血管性血友病因子和血小板表面受体突变的数据库构建及数据分析

背景：血管性血友病因子和血小板表面受体之间的相互作用在血小板黏附、传播、聚集等血栓形成过程中起到关键作用。目前关于血管性血友病因子突变信息的数据库并不完善且血小板表面受体相关的数据库仍未构建。目的：致力于构建血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα相关突变的数据库,以利于相关领域的研究人员快速查找到该分子对的重要突变信息。方法：以数据库Uniprot、VWFdb及文献报道的突变信息为数据源,采用MySQL和Apache为后台数据库和服务器,运用PHP语言开发血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα突变数据库。结果与结论：收集了341条血管性血友病因子,13条血小板糖蛋白Ibα的野生或者突变序列数据,并人工构建A1结构域的虚拟突变3 920条,建立了包括背景介绍、相关病理图册和资料下载等登录页面,初步实现了数据检索、突变位点分析以及虚拟突变位点信息等相关功能。该数据库较全面搜集及分析血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα的数据信息,有利于研究人员对血管性血友病因子和血小板糖蛋白Ibα相关信息的查询,有助于新型抗血栓药物的研发,进一步提高临床诊断和治疗水平。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

2A型血管性血友病vWF的基因突变

目的 研究中国人２Ａ型血管性血友病（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ,ｖＷＤ）的分子病理机理,了解 ｖＷＤ的临床表现型和基因型的相关性。方法 对１２６例先天性出血性疾病患者进行了出血时间、ｖＷＦ：Ａｇ、ＦⅧ：ＣＡｇ、瑞斯脱素诱导的血小板聚集率的检测和ｖＷＦ的血浆多聚物分析。对２Ａ型血管性血友病的患者用多聚酶链反应、变性梯度凝胶电泳,结合测序的方法进行了基因突变的研究。结果 确诊２Ａ型血