新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

新生隐球菌的PCR指纹分析

传统的新生隐球菌的分型主要采用依据荚膜抗原决定簇的血清分型方法。但仅能分成数种血清型,用于菌株间的变异分析显得无能为力。有资料表明相同血清型的新生隐球菌菌株可呈现明显不同的病理、生理反应^[1,2].我们采用PCR指纹技术对新生隐球菌不同分离株进行了DNA多态性分析,现将结果报道如下。一、材料与方法(一)菌株:新生隐球菌参考菌株D48、ATCC64538、ATCC64528为A血清型,RV45981、RV59939、RV60047、RV43185为D血清型,RV52643、RV54135为B血清型,RV52646、RV45978为C血清型,除D48株为WHO赠送外,其余均为比利时热带病研究所赠送。     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

在CGB培养基上生长的A型和D型新生隐球菌

新生隐球菌是临床上重要的致病真菌,在免疫缺陷的患者如艾滋病患者中引起播散性脑膜炎。新生隐球菌有两个变种,并分为5个血清型。文献报道新生隐球菌新生变种的血清型为A、D和AD型,在CGB培养基上不生长;格特变种的血清型为B和C型,能够在CGB培养基上生长。作者报告了3株来自鸽排泄物,能在CGB培养基上生长,血清型为A或D型的新生隐球菌。     

中国致病格特隐球菌的基因亚型分析

目的 探讨中国致病格特隐球菌的基因亚型与世界范围内格特隐球菌的分子流行病学关系。方法 扩增受试格特隐球菌IGS1、PLB1和GEF1位点的部分可变区,检索GenBank上相应位点的序列信息,进行多位点的序列比对和系统发育分析。结果 ①我国VGⅠ基因型和α交配型菌株在3个位点的序列与以菌株WM276为代表的一种基因亚型相同,国内首株VGⅡ基因型和α交配型菌株的序列与温哥华岛致病株R272一致。②针对GEF1基因部分片段的聚类分析准确鉴定受试格特隐球菌的基因型和交配型。结论 中国致病格特隐球菌VGⅠ基因型与世界上分布较广的一种基因亚型相似,首株VGⅡ基因型菌株与温哥华岛致病性弱的VGⅡb基因亚型相似。     

80株中国大陆新生隐球菌环境株表型和分子特征的初步研究

目的了解中国大陆地区新生隐球菌环境株的分布情况,及其表型和基因型特征。方法采用CACA培养基培养1372份来自中国大部分地区私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,分离出新生隐球菌,并对其表型和基因型特征进行分析。结果共分离出80株新生隐球菌,分离阳性率约为5．5％,所有菌株37℃生长良好,有完整荚膜,尿素酶试验阳性。ITS序列分析证实分离出的新生隐球菌均属于血清型A。M13-PCR显示,其基因型为我国及东南亚地区特征性的VNIC型,显示了与临床株的高度一致性。结论中国大陆地区的新生隐球菌临床株与环境株显示了高度的同源性,提示对于易感人群,阻断与相应环境的接触可有效预防新生隐球菌的感染。     

印度的新型隐球菌格特变种

18株由临床分离的菌株用 API 20C 法鉴定为新型隐球菌,再测试尿素酶、酚氧化物酶为阳性,全部菌株均不同化硝酸盐。18株中3株可在 CGB 培养基上生长,血清分型为B 型,属格特变种。其它15株血清分型为 AD     

新生隐球菌生态学研究

目的:研究中国环境中新生隐球菌变种的生态学特点.方法:采集10个城市(3组)鸽粪标本620份和江西贵溪地区澳洲赤桉标本819份;采用咖啡酯玉米山梨醇琼脂(cAcA)培养基分离新生隐球菌,并对菌株进行CGB培养,酚氧化酶、尿素酶、血清型、交配型试验和形态学观察.结果:①不同纬度地区鸽群的新生隐球菌标本阳性率为G1[40°～50°北纬(N)]13%,G2(30°～40°N)50%,G3(20°～30°N)29%,G2显著高于G1(P＜0.01);3组鸽群阳性率基本相同(P＞0.05),平均为81%.②环境分离358株全部37℃生长、酚氧化酶阳性、CGB培养阴性;1株尿素酶阴性;其中101株均为α交配型和A血清型,提示全部为grubii变种;发现环境分离菌株荚膜变异并与其他真菌的自然黏附现象.③从江西贵溪生长的澳洲赤桉未分离到新生隐球菌格特变种.结论:中国环境中以grubii变种为主的新生隐球菌的生态学特点与其所在的地区纬度明显相关:由澳洲赤桉分离新生隐球菌格特变种的研究仍然需要继续进行.     

不同氧浓度对新生隐球菌荚膜的影响

【摘要】 目的 探讨不同氧浓度对新生隐球菌荚膜的影响。方法 以厌氧、微需氧和CO2产气袋建立不同氧浓度（分别为0、8%、15%）培养条件,以大气氧浓度（21%）为正常氧浓度培养条件,以新生隐球菌标准株5株（BLS71、BLS63、ATCC32609、ATCC34874、YD53,分别为血清型A、B、C、D、AD）、临床株1株为研究对象,以常规沙氏液体培养基和含3-（N-吗啡啉）丙磺酸（MOPS）的10%沙氏液体培养基（pH 7.3）为非诱导和诱导培养基,在37 ℃下培养3 d,观察不同氧浓度培养条件下新生隐球菌的荚膜形成及大小。结果 除菌株YD53（血清型AD）外,其余受试菌株均可形成明显的荚膜。在非诱导培养条件下,菌株BLS71、BLS63、ATCC32609和临床株在4种氧浓度培养条件下荚膜大小差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。在诱导培养条件下,菌株BLS71、BLS63和临床株在厌氧培养条件下的荚膜厚度比其余氧浓度条件下的荚膜明显变小（P ＜ 0.05）。结论 缺氧可能抑制新生隐球菌荚膜的形成。 【关键词】 隐球菌,新型; 氧; 荚膜     

CAP64荚膜相关基因在新生隐球菌分型中的意义

新生隐球菌的多聚糖荚膜成分是新生隐球菌血清型分型的物质基础^[1],而CAP64荚膜相关基因是新生隐球菌荚膜合成的必需基因之一^[2],我们根据新生隐球菌血清型DCAP64荚膜基因的序列设计引物,将设计的引物扩增5个标准血清型新生隐球菌,已分型和未分型新生隐球菌临床分离株,以及其他的致病真菌,以寻找引物的型特异性。     

新生隐球菌变种问ITS序列差异的研究

目的 利用真菌核糖体基L大1内转录间隔区(ITS)序列分析和系统进化学分析来研究新生隐球菌上海变种的地位及变种问ITS序列的差异.方法 采用真菌通用引物ITS1、ITS4对12株新生隐球菌不同变种标准株的ITS片段进行PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中11株新生隐球菌标准株的ITS序列,用CLUSTAL W1.83软件多重比对分析序列的差别,MEGA3.1软件处理数据绘制系统进化树.结果 新生隐球菌变种之间ITS序列存在明显差异,存在6种亚型;gattii变种ITS序列存在4种亚型.中国发现的新生隐球菌上海变种S8012与gattii变种在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异.结论 我国发现的上海变种S8012归入gattii变种的ITSC型,原gattii变种RV20186归人gattii变种的ITSF型.     

首次从非AIDS患者中分离出尿素酶阴性新生隐球菌

最近，作者等从一非ＡＩＤＳ又无免疫缺陷的新生隐球菌脑膜炎患者脑脊液中有首次分离出一株尿素酶阴性新生隐球菌，经与尿素酶阳性的新生隐球菌和尿素酶阳性的白念珠菌反复对照，并经动物实验证明，经南京医科大学附属和线医院情报室联机检索，国际上未见类似报告。     

新生隐球菌不同变种所致小鼠原发性皮肤感染的比较

目的：探讨新生隐球菌不同变种在原发性小鼠新生隐球菌皮肤感染中的作用。方法：按照我们建立的原发性皮肤隐球菌感染模型的方法，将新生隐球菌新生变种标准野生株B3501与格特变种标准株ATCC32609分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠，皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程，比较皮损形成与消退的平均时间。结果：2种变种的新生隐球菌皮下接种于BALB／c小鼠后，可以在免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠皮肤上产生丘疹、结节、溃疡、传染性软疣样皮损，皮损可以自愈，真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株只在免疫正常小鼠的皮损形成时间上存在差异。结论：新生变种与格特变种的新生隐球菌均可以造成BALB／c小鼠相似的皮肤感染。推测2种变种对原发性皮肤感染的致病力可能无差异，新生变种发病较多可能与其分布有关。     

新型隐球菌核型的脉冲电泳分析

用脉冲电泳技术分离了包括３个变种、５种血清型在内的２０株新型隐球菌染色体ＤＮＡ，发现其基因组由１０～１２条染色体组成，大小在０．４～２．１Ｍｂ之间，总长度约１５Ｍｂ。特别是注意到电泳核型与血清型之间有相关性，并观察到菌株间的带型也存在不同程度的差异，提示电泳核型分析可作为变种鉴别和种内分型的新的基因型方法。     

荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用

目的探讨新生隐球菌多糖荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用。方法按照笔者建立的原发性皮肤隐球菌感染模型构建方法,将新生隐球菌标准野生株B3501与荚膜缺陷株cap64分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠,皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程,比较皮损形成与消退的时间。结果野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌皮下接种于BALB/c小鼠后,均可以在免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠皮肤上产生结节、丘疹、溃疡、传染性软疣样皮损,皮损可以自愈,真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株感染的病程差异无显著性意义。结论野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌均可以造成BALB/c小鼠相似的皮肤感染。荚膜可能不是小鼠皮肤隐球菌感染的主要毒力因子。     

新生隐球菌L型致病性的实验研究

以稳定新生隐球菌Ｌ型感染小鼠后，部分脑组织中出现长丝体和巨形体。病原分离，新生隐球菌大小不一、形态不规则。病理学检查，各脏器主要表现为间质性炎症。我们认为：①新生隐球菌Ｌ型致病的特征性表现为间质性炎症；②隐球菌性肉芽肿的形成可能与病灶处新生隐球菌变异成Ｌ型有关。     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。