MiRNA-126*靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析

目的：通过对miRNA-126*进行靶基因预测及信号通路生物信息学分析,以期为miRNA-126*靶基因相关实验及其调控肺发育机制的深入研究奠定基础。方法：首先利用microRNA（miRNA）芯片技术分别检测胎龄16 d、19 d和21 d胎鼠肺组织中miRNA-126*的表达水平,进而应用miRGen2.0数据库通过生物信息学方法预测其可能的靶基因,然后对其靶基因集合应用Cytoscape及其插件BiNGO进行功能富集分析（GO-analysis）,最后应用DAVID数据库进行靶基因信号转导通路富集分析（KEGG Pathway analysis）。结果：miRNA-126*表达量在胎龄16 d、19 d和21 d 3组胎肺组织间逐渐上升。miRNA-126*预测靶基因共有422个,其靶基因集合功能富集于葡萄糖醛酸转移酶、糖代谢等分子功能,多细胞器官发育、发育进程等生物学过程及细胞分隔、细胞器界膜等细胞组分上。信号转导通路则显著富集于RNA降解信号通路,以及朊蛋白疾病信号通路中。结论：本研究结果提示miRNA-126*参与了大鼠胎肺发育过程,为今后研究肺发育提供理论基础。     

miRNA-210在新生大鼠缺氧缺血性脑水肿中的作用

目的 探讨miRNA-210在新生大鼠缺氧缺血性脑水肿中的作用。方法 将80只新生大鼠随机分为对照组、生理盐水组、miRNA-210表达抑制组及miRNA-210过表达组,每组20只;各组大鼠再随机分为假手术组及缺氧缺血 （HI） 组,每组10只。HI组新生大鼠结扎左侧颈总动脉后,置于8% O2和92% N2的混合气体缺氧舱中持续2h;假手术组仅游离左侧颈总动脉,但不予结扎和缺氧处理。HI或假手术术后,分别向生理盐水组、miRNA-210表达抑制组和miRNA-210过表达组大鼠颅内注射生理盐水 （2.5mg/kg）,miRNA-210 incubitor （2.5mg/kg） 和miRNA-210 minic （2.5mg/kg）,对照组大鼠不予任何处理。3d后断头,取左侧脑组织,采用荧光定量PCR方法检测miRNA-210的表达;采用干湿质量法检测脑组织含水量;苏木精-伊红染色观察脑组织形态学改变。结果 各组HI新生大鼠脑组织中miRNA-210的表达较相应假手术组均显著下调,脑组织含水量显著上调 （P < 0.05）。与生理盐水HI组比较,miRNA-210表达抑制HI组中miRNA-210的表达显著下调,脑组织含水量显著上调 （P < 0.05）;miRNA-210过表达HI组中miRNA-210的表达显著上调,脑组织含水量显著下调 （P < 0.05）。苏木精-伊红染色结果提示miRNA-210表达抑制HI组水肿改变明显;miRNA-210过表达HI组水肿改变明显改善。结论 新生大鼠脑HI后miRNA-210表达下调,可能参与了新生大鼠缺氧缺血性脑水肿的发生发展。     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠松果体miRNA-182及Clock mRNA的表达变化

目的观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后松果体内小RNA(miRNA)的差异表达,研究其在HIBD导致的昼夜节律紊乱中的作用。方法将7日龄的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为HIBD模型组和假手术组,根据Rice-Vannucci法制作HIBD模型,24h后分别取两组松果体组织,通过miRNA芯片检测及实时荧光定量PCR法(RT-PCR)筛选出HIBD后高表达的miRNA,测定其在各组织(肺、肠、胃、肾、大脑皮层、松果体组织)中的表达差异。利用RT-PCR技术分别测定两组在缺氧缺血后0、24、48、72h松果体中高表达miRNA及靶基因Clockm RNA的表达变化。结果 miRNA芯片结果结合RT-PCR技术筛选出多个和HIBD相关的miRNA,其中miRNA-182表达差异明显。miRNA-182在松果体组织中高丰度表达。HIBD后24h、48hmiRNA-182的表达水平高于对应时间点的假手术组(P0.05);与对应时间点的假手术组相比,HIBD后0hClockm RNA表达水平升高,48h时降低,72h后明显升高(P0.05)。结论 miRNA-182可能参与了HIBD后昼夜节律紊乱的病理生理过程。     

负载miRNA-126的间充质干细胞外泌体在脓毒性休克心功能障碍机制中的研究进展

外泌体在细胞通讯和信息传递之间有着重要的意义。间充质干细胞(MSC)外泌体负载的miRNA-126可以通过调节蛋白表达等途径减轻炎症反应并保护血管内皮, 从而阻断或减轻脓毒症休克心功能障碍, 有望成为脓毒症休克心功能障碍治疗的新途径。     

氨溴索和糖皮质激素对胎鼠肺组织骨形态发生蛋白4表达的影响

目的 探讨产前给予氨溴索、糖皮质激素(地塞米松、倍他米松)对胎鼠肺组织骨形态发生蛋白4(BMP4)表达的影响.方法 18只孕鼠随机分成6组:对照组、氨溴索组、地塞米松1d组和3 d组,倍他米松1 d组和3 d组,每组3只.孕鼠妊娠第19天行剖宫产取胎仔肺组织,通过逆转录聚合酶链反应、免疫组化和免疫印记技术检测各组胎肺BMP4基因转录水平及蛋白表达差异.结果 BMP4 mRNA表达在地塞米松3 d组、倍他米松1、3 d组的表达均明显高于对照组(P<0.05),氨溴索组与地塞米松1 d组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).免疫组化和免疫印记法结果显示,与对照组相比,地塞米松3 d组、倍他米松1 d组及3 d组BMP4表达量显著增加(P<0.01),而氨溴索组、地塞米松1 d组与对照组相比表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 产前给予地塞米松、倍他米松均能显著促进胎肺组织BMP4的表达,提示糖皮质激素可能通过上调BMP4表达促进大鼠胎肺发育.     

汉防己甲素对先天性膈疝大鼠的保护作用

目的：探讨汉防己甲素（TET）产前干预对先天性膈疝（CDH）大鼠的保护作用及机制。方法：将妊娠Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、除草醚组与TET治疗组。后两组孕 9.5 d 时采用除草醚灌胃法建立 CDH 大鼠模型;治疗组自孕18.5 d 起给予 TET 灌胃（每日30 mg/kg,连续3 d）;21 d 对部分孕鼠行剖腹并抽取羊水,观察胎鼠膈疝形成情况。采用 ELISA 法、免疫组化染色法检测羊水和胎肺中 TNF-α 的表达情况。余孕鼠自然分娩,观察各组仔鼠出生后情况。结果：除草醚组胎鼠无论有无膈疝形成均存在肺发育不良,肺及羊水中 TNF-α 的表达均明显升高;TET治疗组胎鼠巨大膈疝的发生率低于除草醚组,肺与羊水中 TNF-α的含量明显较除草醚组少（P＜0.01）。在自然分娩的仔鼠中,TET治疗组仔鼠的 24 h存活率明显高于除草醚组（P＜0.01）。结论：产前应用 TET 能降低CDH大鼠模型胎肺与羊水中 TNF-α 的含量,改善因除草醚诱导的胎鼠肺发育不良,减少巨大膈疝的发生,提高仔鼠的存活率。     

Wnt7b在Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠模型胎肺中的表达

目的 研究Wnt7b在Nitrofen诱导的先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)胎肺中的表达特点,探讨其在CDH肺发育不良发生机制中的可能作用.方法 采用实时荧光定量PCR方法检测Wnt7b基因在妊娠E17.5、E19.5、E21.5的Nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺及正常对照大鼠胎肺中的相对表达量,并用免疫组化方法检测Wnt7b蛋白在胎肺中的表达.结果 正常对照组和CDH组胎肺中Wnt7b mRNA的表达水平均随着胎龄的增加呈下降趋势,其中E17.5胎龄CDH组胎肺中Wnt7b mRNA的表达水平与对照组相比,差异无统计学意义;而E19.5、E21.5胎龄CDH组胎肺中Wnt7b mRNA的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).对E21.5胎龄对照组和CDH组的标本进行免疫组化检测,结果显示Wnt7b免疫阳性细胞主要分布在支气管和细支气管上皮,且CDH组Wnt7b免疫阳性程度(以平均光密度值表示)较正常对照组升高,有统计学差异.结论 Wnt7b mRNA表达量随大鼠胎肺逐渐发育成熟而下降,提示其在胎肺中的表达量与胎肺发育的成熟度有关.CDH组中E19.5、E21.5胎龄时Wnt7b mRNA的表达水平明显高于对照组,是CDH孕晚期胎肺发育滞后的分子基础之一,提示Wnt7b在CDH孕晚期胎肺中表达增高可能参与了肺发育不良.Wnt7b蛋白在肺发育中特异性定位于气道上皮,提示信号町能在肺上皮与间质细胞之间有重要联系,协同促进上皮和间质的发育.     

地塞米松和倍他米松对大鼠胎肺骨形态发生蛋白信号转导的影响

目的：比较产前地塞米松、倍他米松给药对大鼠胎肺骨形态发生蛋白(BMP)信号转导通路的影响。方法：15只孕鼠随机分成5组：对照组、地塞米松治疗1 d组、3 d组和倍他米松治疗1 d组及3 d组。孕鼠妊娠第19天剖腹取胎鼠肺组织,通过RT-PCR、免疫组化和Western blot技术检测各组胎肺BMP4、BMP受体2（BMPR-II）、Smad1、转录活化因子2（ATF-2）基因转录及蛋白表达水平。结果：(1) BMP4 mRNA、BMPR-II mRNA、Smad1 mRNA的表达在倍他米松3 d组、1 d组及地塞米松3 d组均高于对照组(P＜0.05)。(2)免疫组化结果显示：与对照组相比,BMP4、BMPR-II、pSmad1、ATF-2在地塞米松3 d组、倍他米松1 d组及3 d组表达量显著增加(P＜0.01)。(3) Western blot检测显示与对照组相比,BMP4、BMPR-II蛋白在地塞米松3 d组及倍他米松1 d组、3 d组中表达丰富(P＜0.01)。结论：倍他米松、地塞米松可能参与调控大鼠胎肺BMP信号转导过程。对BMP信号转导分子BMP4、BMPR-II、Smad1表达的上调可能是其促胎肺成熟的重要机制之一。［中国当代儿科杂志,2010,12(11)：891-896］     

Ghrelin及受体GHSR表达变化与宫内发育受限仔鼠追赶生长的关系

目的：了解Ghrelin及生长激素释放促分泌素受体（GHSR）表达变化与宫内发育受限（IUGR）仔鼠追赶生长的关系。方法：采用妊娠期食物限制法建立IUGR大鼠模型,孕鼠分娩后,获得限食小于胎龄（SGA）仔鼠和限食适于胎龄（AGA）仔鼠为实验组,不限食适于胎龄（AGA）仔鼠为对照组。于0、20、40日龄取胃底和下丘脑组织,实时荧光定量PCR法（real-time FQ-PCR）分别测定Ghrelin mRNA和GHSR mRNA;免疫组织化学法测定Ghrelin蛋白和GHSR蛋白。结果：0日龄限食SGA组仔鼠胃底组织中Gherlin mRNA和蛋白表达均高于限食AGA组和对照组,下丘脑GHSR mRNA的表达低于限食AGA组和对照组;20日龄SGA组追赶生长仔鼠胃底Ghrelin蛋白、下丘脑GHSR mRNA和蛋白的表达高于SGA未追赶生长和对照组仔鼠;40日龄时3组间则差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Ghrelin-GHSR可能参与了宫内IUGR胎鼠的生理调节或病理过程,且可能在出生后参与了SGA个体早期追赶生长的调控。     

维生素 D 缺乏对子代大鼠肺形态结构及血小板源性生长因子-A 表达的影响

目的：研究孕期维生素 D（VitD）缺乏对子代大鼠肺形态发育及血小板源性生长因子-A（PDGF-A）表达的影响。方法：雌性Sprague-Dawley (SD) 大鼠随机分为对照组、VitD 缺乏模型组（每组6只）。对照组正常饲养;模型组予以避光、不含 VitD 的饲料喂养,2周后与成熟 SD 雄性大鼠交配,每组取孕20 d的胎肺及生后1 d 新生鼠肺,光镜及电镜下观察肺形态结构, RT-PCR 及 Western blot 分别检测肺组织PDGF-A mRNA及蛋白水平的表达。结果：光镜下,模型组子鼠肺泡平均表面积、平均呼吸膜周径均小于对照组（P<0.05）,平均肺泡间隔厚度大于对照组（P<0.05）;电镜下,模型组子鼠的板层小体数量明显少于对照组,成熟细胞器较少见。RT-PCR 及 Western blot结果显示模型组子鼠肺组织PDGF-A mRNA和蛋白表达水平均低于对照组（P<0.05）。结论：孕期 VitD 缺乏抑制孕晚期胎鼠及新生大鼠的肺形态发育。VitD 缺乏能显著抑制肺组织 PDGF-A 表达;PDGF-A表达减低可能是VitD缺乏抑制大鼠肺发育的重要机制之一。     

Sprague-Dawley大鼠肺发育中miR-431的连续表达研究

目的 探讨miR-431在肺发育形态学中的潜在作用。方法 根据肺发育分期,选择SpragueDawley大鼠孕16 d（E16）、孕19 d（E19）、孕21 d（E21）、生后1 d（P1）、生后3 d（P3）、生后7 d（P7）、生后14 d（P14）及生后10周（P10周）成年大鼠的肺组织作为观察点,利用苏木精-伊红染色（HE）及透射电镜方法进行肺组织形态学观察;利用荧光原位杂交和实时荧光定量PCR技术检测肺发育关键时期（E19、E21及P3）肺组织中miR-431的表达情况。结果 E19组胎肺组织发现关键事件板层小体及Ⅱ型肺泡上皮细胞的出现;随胎龄增加板层小体数量增加,并出现聚集与排出;生后肺泡形成迅速发生,间质变薄,微血管系统逐渐成熟。荧光原位杂交及实时荧光定量PCR结果均显示随着胎龄的增加,miR-431的表达量逐渐降低（P < 0.05）。结论 获得系统而连续的肺发育形态学资料。miR-431在肺发育过程中可能起重要的负向调控作用,为后续进一步研究肺发育及相关性疾病的机制提供基础和方向。     

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??Objective??To observe the expression features of peripheral blood microRNA??miR??-126 in children with asthma and to investigate the influence of miR-126 downregulation on release of interleukin??IL??-4 in mast cells and its possible mechanism. Methods??The peripheral blood of healthy subjects??control group?? and astham children??asthma group?? were enrolled. The asthma group included 6 children who were treated in Nanjing Children’s Hospital from September to December of 2015. The levels of serum miR-126 were measured in both groups by quantitative real-time polymerase chain reaction??RT-PCR??. After stimulation with lipopolysaccharide??LPS?? on P815??miR-126 expression was detected by RT-PCR. P815 were transfected with miR-126 negative control??negative control group?? and miR-126 inhibitor??miR-126 inhibitor group?? respectively. The levels of IL-4 in supernatants were detect by ELISA??and the levels of phosphorylated P38 were detected by Western Blot in two groups. Results The levels of peripheral blood miR-126 in asthma group were significantly higher than those in control group??P??0.05??. In LPS stimulatedP815??miR-126 expressionincreased??P??0.05??. The levels of IL-4 and phosphorylated P38 in the miR-126 inhibitor group werelower than those in the negative control group??with statistical significance??P??0.05??. Conclusion The expression of peripheral blood miR-126 increases in asthma children. Down-regulation of miR-126 may suppress IL-4 release from mast cells by reducing the expression of phosphorylated P38.     

血浆miRNA-497在小儿脓毒症心肌损伤中的表达及其临床意义

目的 探讨血浆miRNA-497在小儿脓毒症心肌损伤中的表达及其临床意义。方法 纳入148例脓毒症患儿,依据其是否发生心肌损伤分为心肌损伤组（58例）和非心肌损伤组（90例）,比较两组血浆miRNA-497、心肌肌钙蛋白I （cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、N末端B型钠尿肽前体（NT-proBNP）、降钙素原（PCT）、C-反应蛋白（CRP）水平及左室射血分数（LVEF）的变化。绘制受试者工作特征曲线（ROC）,评价血浆miRNA-497、cTnI、CK-MB对心肌损伤的诊断价值。应用Pearson相关分析法分析miRNA-497与cTnI、CK-MB、NT-proBNP、PCT、CRP及LVEF的相关性。结果 心肌损伤组血浆miRNA-497、cTnI、CK-MB、NT-proBNP、PCT及CRP水平均明显高于非心肌损组（P < 0.05）。血浆miRNA-497、cTnI、CK-MB及三项联合诊断心肌损伤的曲线下面积（AUC）分别为0.918、0.931、0.775、0.940。miRNA-497的最佳阈值为2.05时,其诊断心肌损伤的敏感度和特异度较好,分别为90.4%和91.2%。相关分析显示,心肌损伤患儿血浆miRNA-497与cTnI的相关性较好（r=0.728,P < 0.01）。结论 血浆miRNA-497对小儿脓毒症心肌损伤的诊断价值与cTnI相当,有望作为早期诊断心肌损伤的潜在标志物。     

Hoxa5基因在先天性膈疝大鼠模型胎肺中的表达

目的 研究Hoxa5基因在先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)胎肺中的表达特点以及探讨其在CDH肺发育不良发生机制中的可能作用.方法 采用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,QPCR)方法检测Hoxa5基因在妊娠第17.5天、19.5天、21.5天的nitrofen诱导CDH大鼠模型胎肺及正常对照大鼠胎肺巾的相对表达量.结果 正常对照组胎肺中Hoxa5 mRNA的表达水平随着胎龄的增加旱下降趋势,其中第21.5天胎肺中Hoxa5 mRNA的表达水平显著下降,与其他二胎龄点相比差异有统计学意义(P＜0.05);CDH组中Hoxa5 mRNA的表达趋势与正常胎肺相似,即随胎龄的增加其表达量下降,其当中第21.5天胎肺中Hoxa5 mRNA的表达水平明显降低,与其他二胎龄点相比差异有统计学意义(P＜0.05).第17.5天与19.5天胎龄CDH组胎肺中Hoxa5 mRNA的表达水平分别与相应对照组相比,差异无统计学意义;而妊娠晚期(第21.5天胎龄)CDH组胎肺中Hoxa5 mRNA的表达水平高于对照组.差异具有统计学意义.结论 正常对照组中第21.5天胎龄时Hoxa5 mRNA的表达水平显著降低,提示Hoxa5 mRNA在孕晚期的低表达是正常肺发育的分子基础之一;而CDH组中第21.5天胎龄时Hoxa5 mRNA的表达水平明显高于对照组,提示Hoxa5在孕晚期CDH胎肺中Hoxa5的高表达可能是CDH肺发育不良形成机制之一.     

先天性膈疝肺动脉高压的实验研究

目的研究先天性膈疝（Congenital diaphragmatic hernia,CDH）肺发育不良中肺动脉高压（Dulmonary hypertension,PH）的量化指标,探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在CDH胎肺中的表达及在CDH肺动脉高压发生中的可能作用,探讨地塞米松（Dexamethasone,Dex）对VEGF和CDH肺发育的影响。方法采用Nitrofen诱导CDH模型胎鼠并分组：Dex组予以产前Dex治疗,CDH组未给予Dex,另取正常胎鼠为对照组。采用组织学测量、肺蛋白含量检测等方法,测定出平均肺泡面积、平均肺泡间隔厚度、每高倍视野肺血管数、动脉中膜厚度占外径比（MT％）、管壁面积占血管总面积比（WA％）、管腔面积占血管总面积比（LA％）、左肺与体重比、左肺蛋白含量与体重比等;实时荧光定量PCR（QPCR）和免疫蛋白印迹（Western blotting）方法检测各组胎肺中VEGF的表达及相对含量。结果与对照组相比,CDH组胎肺显著发育不良,包括肺微小动脉结构明显异常,表现为每高倍视野肺血管数减少、MT％增大、WA％增大,LA％减小（均P〈0．05）;另外VEGFmRNA及蛋白水平均明显升高（P〈0．05）。与CDH组相比,Dex组胎肺发育明显改善,表现为每高倍视野肺血管数增加、动脉中膜厚度占外径比减小、管腔面积占血管总面积比增大（均P〈0．05）;但VEGF mRNA及蛋白水平未发现明显变化（P〉0．05）。结论VEGF在CDH胎肺中的表达增高可能是CDH肺发育不良形成机制之一;产前地塞米松治疗可明显改善肺微小动脉结构异常及肺发育不良,但未发现对VEGF的表达有影响,提示Dex可能并非通过调节VEGF的表达而发挥改善肺动脉高压及肺发育不良的作用。