实时荧光定量RT-PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域,本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题,以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

实时荧光定量RT-PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测.为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域,本文就荧光定量RT-PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸(mRNA)存在的几个问题,以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述.     

实时荧光定量RT—PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域，本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题，以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

荧光定量PCR检测HCV-RNA的研究进展

荧光定量PCR(FQ-PCR)是近几年来发展起来的可用于检测丙型肝炎病毒(HCV)感染的一种新手段。现介绍目前常用的荧光定量PCR技术,并通过与常规定性PCR和ELISA法的比较阐明该技术对HCV进行定量检测的临床价值。     

1种血清戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立一种从血清样本中基于荧光定量PCR的快速检测戊型肝炎病毒的方法。方法 (1)从GeneBank获得包含我国流行的3个基因型的100条戊型肝炎病毒序列。选择合适的序列设计合成荧光定量引物和Tanqman探针。(2)将引物从血清模板中PCR扩增片段在体外转录产物作为荧光定量PCR标准品,同时引入了微量核酸裂解液。(3)取10份临床戊肝阳性患者血清样品,用建立的方法检测,进一步验证该方法。结果该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性患者的血清样本,而对其他病毒传染病患者血清检测为阴性结果,证实该RT-PCR检测技术的特异度较高、可靠性较好。对10份临床血清样品的验证检测进一步证实了该方法快速、便捷、灵敏且重复性好。结论建立了一种适用于中国人群戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。可满足戊型肝炎病毒临床早期快速诊断的需求。     

p53基因第8外显子实时荧光PCR方法的建立

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p53基因第8外显子的方法。方法用酚-氯仿抽提法提取云南省中医院的常规体检患者的DNA,应用SYBR GreenⅠ作荧光染料,通过检测PCR产物中荧光讯号的强度来定量p53基因,重复测定该标本18次,以此建立检测p53基因的实时荧光定量PCR方法。结果融解曲线分析表明该方法特异可靠。结论该研究建立了p53基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法简便、特异、重复性好、可信度高,为p53基因第8外显子的定量研究提供了理想的检测方法。     

人肠道乳酸杆菌的荧光定量PCR定量检测方法的研究

目的应用实时荧光定量PCR技术对健康人粪便内乳酸杆菌进行定量分析,建立乳酸杆菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16SrDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并和用传统方法所获得的结果进行比较。结果结果显示荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌之间无统计学差异（P〉0.05）。结论荧光定量PCR技术比传统方法特异性高、敏感性强,临床上可用此方法对患者肠道乳酸杆菌进行定量分析。     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

荧光定量PCR技术在结核杆菌检测中的应用

目的：建立结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法：建立检测结核杆菌的荧光定量PCR方法并进行特异性、敏感性、重复性实验，对临床样品进行检测分析。结果：该方法的敏感性达到了1Pg，且特异性高．重复性好。应用荧光定量PCR法及抗酸染色、结核杆菌培养法，对332例活动性肺结核患者晨痰、215例活动性肺结核患者外周血、187例结核性胸膜炎患者胸水进行检测．荧光定量PCR技术阳性率分别为53．0％（176／332）、34．4％（74／215）、36．9％（69／187），经统计学比较分析，3种方法检测率差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：荧光定量PCR技术具有简便、快速、防污染、敏感性与特异性高等优点，是结核病诊断的有效方法之一。[著者文摘]     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究

目的建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色葡萄球菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法。结果成功构建了金黄色葡萄球菌重组质粒标准品和金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;将模拟标本与分离培养对比,两者符合率为100%。结论金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为金黄色葡萄球菌感染诊断及食源性金黄色葡萄球菌污染的快速检测提供依据,可用于临床感染诊断及食品卫生监管、商品检验检疫等。     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床应用

目的运用终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA,探讨其临床应用价值。方法运用本研究组制备的引物和荧光探针分别将HBV-DNA质粒及临床标本进行普通PCR和实时荧光定量PCR反应,再将普通PCR产物在荧光测定仪上测定荧光强度,与实时荧光定量PCR结果相比较,观察其符合程度。另外,运用相同方法比对本研究制备的PCR体系与市售荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的符合程度。结果终点法荧光定量PCR与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA质粒及临床标本结果一致(P>0.05),与市售荧光定量PCR试剂比较,其符合程度较高(P>0.05)。结论终点法荧光定量PCR检测临床HBV-DNA标本稳定可靠,可作为荧光定量PCR的应用方法之一在基层医院推广应用。     

早期皮损组织液的定量PCR检测在梅毒诊断中的价值分析

目的探讨早期皮损组织液的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测在梅毒诊断中的价值。方法选择2014年9月至2016年9月该院收治的40例疑似梅毒患者,患者在判断为疑似病例后,于次日清晨抽取5mL静脉血送至免疫实验室,进行甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)、梅毒螺旋体抗体ELISA检测;并收集皮损组织液,进行FQ-PCR检测;均采用苄星青霉素治疗3、6个月后再次检测,记录转阴率。结果 ELISA、FQ-PCR总检出率比较,差异无统计学意义[97.50%(39/40)与95.00%(38/40),P0.05];ELISA、FQ-PCR总检出率均明显比TRUST总检出率高,差异有统计学意义[97.50%(39/40)与67.50%(27/40),95.00%(38/40)与67.50%(27/40),P0.05];在治疗后3个月、6个月时,ELISA、FQ-PCR转阴率均明显高于TRUST,差异有统计学意义(P0.05),FQ-PCR转阴率和ELISA比较,差异无统计学意义(P0.05);在FQ-PCR检测结果中,治疗后TP-DNA定量平均值均得到明显降低,Ⅰ期、Ⅱ期和治疗前比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论采用早期皮损组织液FQ-PCR可有效测定梅毒螺旋体DNA,有利于梅毒诊断,临床应用价值高。     

荧光定量PCR/熔解曲线分析法快速鉴定葡萄球菌菌种

目的：建立一种基于葡萄球菌16～23s rRNA间隔区序列特征的荧光定量PCR／熔解曲线分析鉴定方法，以快速鉴定葡萄球菌菌种。方法：在葡萄球菌16s rRNA 3′端和23s rRNA5′端分别设计上、下游引物．用荧光定量PCR方法扩增各个实验菌株的16～23s rRNA间隔区序列。然后分析各扩增产物的熔解曲线．以确定各个菌种熔解曲线特征，并以此为依据对15株葡萄球菌临床分离株进行鉴定。结果：设计的引物对成功地扩增了葡萄球菌所有实验菌株，对扩增产物的熔解曲线分析可初步鉴定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌。以VITEK2鉴定结果为标准，荧光定量PCR／熔解曲线分析法鉴定菌种的准确率为67％（10／15）．整个实验可在1h内完成。结论：荧光定量PCR／熔解曲线分析法有望成为临床实验室快速鉴定葡萄球菌菌种的新方法。[著者文摘]     

FQ-PCR检测肠黏膜结核杆菌DNA对肠结核的诊断价值

目的建立一种实时定量检测结核分枝杆菌（MTB）插入序列IS6110 DNA的方法,探讨其在肠结核（ITB）诊断中的价值。方法采用FQ-PCR技术对36例内镜活检ITB标本（30例石蜡、6例新鲜组织）、36例Crohn’s disease标本（16例石蜡手术标本,15例石蜡内镜活检标本,5例新鲜内镜活检组织）及34例阴性对照标本进行IS6110 DNA的实时定量检测,并比较上述标本抗酸染色结果。结果13例ITB抗酸染色阳性,CD无1例阳性,抗酸染色对ITB诊断的敏感性36.11%。MTBIS6110DNA检测结果：23例ITB（63.89%）阳性,6例CD（16.67%）阳性,另有1例阳性为升结肠腺癌癌旁正常组织。MTBIS6110 DNA在ITB与CD中的阳性率差异有统计学意义（P〈0.05）。FQ-PCR对ITB诊断的敏感性为63.89%,特异性83.33%。FQ-PCR敏感性显著高于抗酸染色（P〈0.05）。MTBIS6110 DNA阳性的ITB标本其定量结果范围为2.44×10^-4-2.26×10^1拷贝/细胞。结论FQ-PCR检测MTBIS6110 DNA是一种快速有效的ITB诊断方法,其定量范围广,检测灵敏度高。对活检组织少、病理改变不典型、抗酸染色阴性组织的诊断和鉴别诊断尤有意义。     

细菌分离培养与实时荧光定量-聚合酶链反应用于健康人群脑膜炎奈瑟菌携带率研究

目的 了解河北省部分地区健康人群脑膜炎奈瑟菌(Nm)带菌状况,评价实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)作为菌株分离培养法的补充在健康人群带菌调查中的应用价值。 方法 按年龄分层整群随机抽取577人采集咽拭子,采用Nm分离培养和FQ-PCR法同时检测,并使用血清学和分子生物学方法分群。 结果 分离到18株Nm菌株,总阳性率3.12%,其中不可分群最多(9株),其次为B群(3株)、W135群(3株)、X群(2株)、C群(1株)。FQ-PCR检测阳性样本46份,总阳性率7.97%,其中B群最多(13份),其次为W135群(12份)、不可分群(11份)、X群(7份)、C群(3份)。 结论 细菌培养和FQ-PCR均提示这些地区健康人群携带Nm血清群多样化。FQ-PCR检测方法在发现病原体及分群方面比传统菌株分离培养方法都有显著提升,可作为传统方法的有力补充。     

两种方法对丙型肝炎病毒检测的对比研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）在检测丙型肝炎病毒（HCV）方面的差异。方法 60例确诊为丙型肝炎的住院患者样本作观察组,80例健康体检人群样本作健康对照组,应用FQ-PCR和ELISA分别对这两组样本进行HCV-RNA和抗HCV抗体（抗-HCV）检测。结果 60例观察组样本中,FQ-PCR和ELISA分别检出阳性54例和49例,阳性率分别为90%和81.67%,80例健康对照组样本中,FQ-PCR和ELISA分别检出阴性80例和77例,阴性率分别为100%和96.25%。结论在检测HCV方面,FQ-PCR比ELISA更具灵敏性和特异性,其结果更加符合患者真实情况,且FQ-PCR检测HCV具有更好的临床应用价值,若两种方法同时使用,则可大大提高临床对丙型肝炎的准确诊断。     

实时荧光聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA诊断肺结核价值

目的探讨实时荧光聚合酶链反应(FQ-PCR)检测支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TBDNA)诊断肺结核的临床价值。方法选取我院收治的115例肺结核患者作为研究对象,所有患者均进行支气管肺泡灌洗液TB-DNA检测、血清结核分枝杆菌特异性抗原(TB-SA)抗体检测、痰涂片抗酸染色镜检等。结果支气管肺泡灌洗液TB-DNA检测、血清TB-SA抗体检测、痰涂片抗酸染色镜检诊断肺结核的敏感度分别为65.2%(75/115)、50.4%(58/115)、20.9%(24/115)。支气管肺泡灌洗液检测TB-DNA诊断肺结核的敏感度显著高于血清TBSA抗体、痰涂片抗酸染色镜检(均P0.05)。结论采用FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液TB-DNA诊断肺结核具有较高的敏感度。     

荧光定量PCR技术检测结核分支杆菌DNA的应用价值

目的评价荧光定量PCR技术检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法应用荧光定量PCR法及抗酸染色、结核杆菌培养法,对179例活动性肺结核患者晨痰、123例活动性肺结核患者外周血、34例结核性胸膜炎患者胸水、20例非结核性呼吸系统疾病患者的晨痰标本进行检测。结果179例活动性肺结核患者晨痰、123例活动性肺结核患者外周血、34例结核性胸膜炎患者胸水,涂片抗酸染色阳性率分别为20．67％（37／179）、0．00％、0．00％;细菌培养阳性率分别为41．34％（74／179）、0．00％、2．94％（1／34）;荧光定量PCR技术阳性率分别为64．25％（115／179）、38．21％（47／123）、44．12％（15／34）。3种标本荧光定量PCR技术阳性率高于抗酸染色和结核杆菌培养,经统计学处理发现,差异有统计学意义。用荧光定量PCR技术检测临床标本特异性为95．00％。结论荧光定量PCR技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性高等优点,是结核病诊断的有效方法之一。     

荧光定量聚合酶链反应检测杜克雷嗜血杆菌的实验研究及临床应用

目的：建立荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测杜克雷嗜血杆菌(HD)的方法，并作临床应用评价。方法根据HD的基因库序列设计引物对2株参考株进行扩增，证实其特异性；再以10倍稀释不同浓度模板扩增测定其敏感度；同时检测76份生殖器溃疡处分泌物标本，每份标本同时作HD涂片和培养。结果：2株不同来源的HD参考株均出现特异性扩增片段，扩增片段大小为60bp；其敏感度为10拷贝／μ1。将FQPCR用于检测76例HD培养阴性的生殖器溃疡分泌物标本，结果4例阳性。结论：FQPCR是一种高灵敏度、高特异性和高精确性的检测生殖器溃疡标本中HD的实验诊断方法，可用于临床诊断HD感染。