DCC基因对乳腺癌细胞株MCF-7的作用

目的 克隆人类DCC基因并构建其真核表达载体plRES2-AcGFP1/DCC,将人DCC基因转染人乳腺癌细胞MCF-7中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 构建DCC基因表达载体plRES2-AcGFP1/DCC,用脂质体法将DCC基因的真核质粒表达载体pIRES2-AcGFP1/DCC导人人乳腺癌细胞MCF7中,细胞计数、生长曲线、细胞黏附分析、软琼脂实验检测转染后细胞的生物学特性变化.结果 将逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)扩增后的产物克隆到真核表达载体pIRES2-AcGFP1/DCC上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列,转染乳腺癌MCF-7细胞后,DCC基因的表达明显增强.细胞计数和细胞生长曲线结果表明,转染后的MCF-7/DCC细胞生长速度明显地低于亲代的MCF-7和MCF-7/vect细胞(P＜0.05).细胞黏附分析显示,MCF-7/DCC细胞的黏附率较其他两组明显降低(P＜0.05).MCF-7/DCC与MCF7细胞的克隆形成率分别为34％、68％,MCF-7/DCC细胞的克隆形成率低于亲本细胞(P＜0.05).结论 DCC基因可有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖、黏附能力.     

转染TSLC1基因肝癌细胞株BEL-7402生物学特性的研究

目的 将人TSLCl基因转染人肝癌细胞BEL-7402中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 用脂质体法将TSLCl基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/TSLCl导人人肝癌细胞株BEL-7402中,G418筛选克隆,再以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot的方法检测TSLCI的表达,细胞计数、流式细胞术及裸鼠负荷瘤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 TSLCl在BEL-7402细胞中的表达可抑制BEL-7402细胞的生长,BEL-7402-TSLCI与BEL-7402比较s期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加.转染后的BEL-7402-TSLCl细胞的凋亡明显增加,转染后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论 TSLCl基因的转染可以抑制BEL-7402细胞的增殖、诱导肝癌细胞的凋亡,为肝癌的基因治疗提供理论依据.     

大鼠骨髓间充质干细胞经低氧诱导因子-1α基因转染后的生物学特性

目的 评价大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染后的生物学特性.方法 将构建好的HIF-1α基因表达载体(pcDNA3.1-HIF-1α)运用电穿孔法转染入第3代BMSCs中得到稳定表达HIF-1α的BMSCs( BMSCs-HIF-1α细胞).以单纯BMSCs和电转染pcDNA3.1的BMSCs( BMSCs-pcDNA3.1细胞)作为对照.采用免疫细胞化学法鉴定HIF-1α基因表达载体是否转染成功;低氧培养后,采用Western blot法测定HIF-1α表达;流式细胞术对转染后细胞进行周期与凋亡的检测,记录G1期、G2期和S期细胞比例,计算增殖指数(PI);MTT法绘制细胞生长曲线,记录细胞数目.结果 BMSCs-HIF-1α细胞核内充满蓝紫色深染颗粒,其余两种细胞未见深染颗粒.与BMSCs和BMSCs-pcDNA3.1细胞比较,BMSCs-HIF-1α细胞HIF-1α表达上调,细胞凋亡率降低,S期和G2期细胞比例和PI升高,G1期细胞比例降低,细胞数目增多(P＜0.05).BMSCs和BMSCs-pcDNA3.1细胞上述各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIF-1α基因成功转染入大鼠BMSCs.     

腺病毒介导的野生型p53基因逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的研究

目的 探讨野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的逆转作用及其机制.方法 选用含野生型p53基因的重组腺病毒载体,转染乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A,绘制细胞生长曲线,利用流式细胞计数仪检测细胞周期分布及凋亡分析、TUNEL法检测细胞凋亡的发生,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹转移检测p53基因的表达情况.结果 野生型p53基因转染MCF-7/A后的24、48 h均检测到p53基因的表达,并显著抑制MCF-7/A细胞的增殖;细胞周期发生改变,转染后的MCF-7/A的G0%G1期DNA百分含量(76.22%)明显高于对照组(43.64%,P<0.05),凋亡率(10.76%)与对照组(1.48%)之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 重组腺病毒介导的野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A的耐药性有明显的逆转作用,其机制可能是引起明显的G1期阻滞并诱导细胞凋亡.     

人肝细胞生长因子转染L02细胞的锌指基因差异表达筛选

目的构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达载体,在L02细胞中表达hHGF并筛选其中的差异表达基因。方法构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定;其转染L02细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染L02细胞后,提取总mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的hHGF真核表达载体pcDNA3.1(-)-hHGF经酶切和测序鉴定正确;转染L02细胞后经蛋白免疫印迹证实hHGF存在明确表达;pcDNA3.1(-)及pcDNA3.1(-)-hHGF分别转染L02细胞后提取总RNA,经基因表达谱芯片分析发现,表达水平显著上调和下调的基因分别有404个和145个,在表达显著上调的基因中包含7种锌指基因。结论筛选出了hHGF转染L02细胞后的差异表达基因,为其作用机制及与锌指蛋白相关性的研究提供了重要依据。     

乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS1)真核表达载体pcDNA3.1/myc-BRMS1,为研究抑制恶性肿瘤转移的机制奠定基础。方法设计含有HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的一对引物,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人乳腺癌细胞株MCF-7中扩增到BRMS1的cDNA基因片断,经回收、纯化、酶切后,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His( )A上,鉴定正确后并转染人胚肾细胞HEK-293进行Western blot验证其是否表达。结果琼脂糖凝胶电泳及基因测序证实重组的pcDNA3.1/myc-BRMS1cDNA的碱基组成与GenBank中的人BRMS1cDNA的基因片断组成相同。结论成功构建了乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体并测序鉴定。     

HSPb1真核表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中表达的研究

目的:构建重组人HSPb1真核表达载体质粒,为研究HSPb1与乳腺癌发生和化疗耐药的关系做准备。方法:从人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计引物调取目的基因片段,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH-5α,筛选菌落并抽提质粒。测序正确后双酶切克隆进入真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1-HSPb1。用pcDNA3.1-HSPb1转染人乳腺癌细胞MDA-MA-231,RT-PCR法和Western blot法鉴定重组质粒在其中的表达。结果:经酶切证实重组质粒pcDNA3.1-HSPb1含有目的基因HSPb1。RT-PCR和Western blot检测表明,mRNA和蛋白水平,转染细胞HSPb1的表达均明显增强。结论:pcDNA3.1-HSPb1真核表达载体构建成功,它在乳腺癌细胞中可高表达目的基因,为进一步研究HSPb1在乳腺癌发生及化疗耐药中的作用奠定了基础。     

miR-584-5p通过下调MMP-14抑制乳腺癌细胞生物学行为

目的 探讨微小RNA-584-5p(miR-584-5p)对乳腺癌细胞生物学行为（增殖、迁移和侵袭）的影响及其作用机制。方法 选择人正常乳腺上皮细胞MCF10A及乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7；取对数生长期的MCF-7细胞，应用Lipofectamine TM 2000转染试剂盒对其进行转染，并分为7组：空白组（未转染的MCF-7细胞）、模拟物-阴性对照组（mimic-negative control,mimic-NC,mimic-NC组；转染mimic-NC）、miR-584-5p mimic组（转染miR-584-5p mimic）、pcDNA组[转染过表达基质金属蛋白酶-14(MMP-14)的pcDNA3.1质粒阴性对照（pcDNA3.1）]、MMP-14组[转染过表达MMP-14的pcDNA3.1质粒（pcDNA3.1-MMP-14）]、mimicNC+MMP-14组（共转染mimic-NC和pcDNA3.1-MMP-14）及miR-584-5p mimic+MMP-14组（共转染miR-584-5p mimic和pcDNA3.1-MMP-14）。荧...     

SOX9基因真核表达载体转染诱导BMSCs分化为类髓核细胞

目的椎间盘退行性变的生物学治疗方法是骨科学研究热点,寻找一种有效诱导BMSCs向椎间盘细胞分化的方法成为应用细胞移植治疗椎间盘退变的必要前提。探讨重组质粒pcDNA3.1IE-SOX9 Flag体外转染诱导兔BMSCs向类髓核细胞分化的影响。方法构建真核表达载体pcDNA3.1IE-SOX9 Flag。取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并鉴定;流式细胞仪检测细胞表面标记。将第3代BMSCs随机分为转染组、阴性对照组和空白对照组。转染组转染pcDNA3.1IE-SOX9Flag重组质粒,阴性对照组转染质粒pcDNA3.1,空白对照组不转染任何质粒。将构建好的重组质粒pcDNA3.1IE-SOX9Flag转染第3代BMSCs,72h后加入浓度为500mg/L的G418筛选7d后,改为浓度200mg/L的G418维持筛选压力并培养转染细胞。取各组BMSCs采用RT-PCR检测SOX9和Ⅱ型胶原基因(Col2al)的mRNA表达,Western blot检测SOX9蛋白的表达,免疫组织化学染色观察Ⅱ型胶原的表达。结果 BMSCs成骨诱导7d后ALP染色呈阳性;CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。成功构建了真核表达载体pcDNA3.1IE-SOX9Flag。将重组质粒转染兔BMSCs,72h后转染效率为34.32%±1.75%;转染2周后BMSCs形态改变,呈多角形或椭圆形,细胞体积增大,增殖速度减缓,与椎间盘髓核细胞生长特点十分接近。RT-PCR鉴定发现转染组细胞SOX9 mRNA和Col2al mRNA表达阳性,对照组均为阴性。Westernblot检测发现转染组SOX9基因蛋白表达阳性,对照组未见表达。转染组BMSCs的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。结论 SOX9基因真核表达载体成功转染兔BMSCs,被转染的干细胞向类髓核细胞分化,为进一步研究应用BMSCs移植治疗椎间盘退行性变奠定了理论基础。     

下调HDAC6表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制

目的：探讨下调HDAC6表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响及其分子机制。 方法：分别用HDAC6 siRNA和阴性siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,以未处理的MCF-7细胞为空白对照,分别用RT-PCR和Western blot方法检测细胞HDAC6与p21基因和蛋白的表达,CCK-8试剂盒和流式细胞术分别检测细胞增殖与细胞周期,并用TUNEL法检测细胞凋亡。 结果：干扰效果验证结果显示,HDAC6 siRNA转染能有效降低MCF-7细胞HDAC6 mRNA和蛋白的表达（均P<0.05）,而阴性siRNA无此作用（P>0.05）。与空白对照组比较,HDAC6 siRNA组细胞增殖受到明显抑制,细胞G0/G1期比例增加,S期比例减少,细胞的凋亡率明显增加（均P<0.05）;阴性siRNA组无上述改变（均P>0.05）。HDAC6 siRNA组细胞p21 mRNA与蛋白的表达均较空白对照组和阴性siRNA组明显升高（均P<0.05）。 结论：下调HDAC6的表达能抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,诱导细胞G0/G1期阻滞,并促进细胞凋亡,其机制可能与升高p21表达有关。     

脆性组氨酸三联体基因对胆管癌细胞凋亡的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体(FHIT)基因对胆管癌细胞株QBC939凋亡的影响,探讨FHIT基因对细胞周期蛋白Cyclin D1的调控作用.方法 通过构建重组人FHIT真核表达质粒转染QBC939细胞,应用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化,并通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测胆管癌细胞Cyclin D1表达的变化.结果 成功构建出重组人FHIT真核表达质粒并转染入QBC939细胞,转染后QBC939细胞的凋亡率明显增高(25.8%比30.9%比55.4%,P<0.05);并且Cyclin D1 mRNA表达下降至原细胞株的0.03倍,该基因蛋白质的表达也明显下降(0.33±0.02对比0.33±0.01比0.14±0.02,P<0.05).结论 FHIT基因可以促进QBC939细胞凋亡,并能下调Cyclin D1基因的表达.     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

转染人高迁移率族蛋白1反义基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨反义高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法　应用分子克隆技术构建反义HMGB1基因真核表达载体pcDNA3 1/anti HMGB1,用脂质体法将其导入人胰腺癌细胞PANC 1中,经G4 18筛选获得可稳定表达反义HMGB1的人胰腺癌细胞克隆,通过逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和噻唑蓝比色法检测转染4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况。结果　获得了pcDNA3 1/anti HMGB1真核表达质粒,pcDNA3 1/anti HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P <0 .0 1)、肿瘤细胞增殖能力明显受到抑制(P <0. 0 1) ,并出现细胞周期G1期阻滞、凋亡细胞百分数增加。结论　反义HMGB1基因的表达能有效抑制胰腺癌细胞的体外增殖并促进细胞凋亡。     

重组的r-Caspsae-3促凋亡基因体内外治疗胰腺癌的试验研究

目的 观察重组活化的Caspsae-3(r-Caspase-3)促凋亡基因对胰腺癌细胞(PC-Ⅱ)及裸鼠皮下种植瘤的治疗作用。方法 采用先前构建的r-Caspase-3促凋亡基因转染胰腺癌细胞，细胞形态学、DNA电泳、流式细胞学观察胰腺癌细胞凋亡状况；用脂质体-pcDNA3．1( )／r-Caspase-3复合物，治疗人胰腺癌细胞裸鼠种植瘤，观察肿瘤生长速度并计算肿瘤体积大小。结果 DNA电泳、流式细胞学可分别观测到特征性的DNA Ladder和凋亡峰，皮下种植肿瘤治疗后生长速度开始减缓，组织切片HE染色可见散在凋亡细胞；对照组肿瘤生长速度明显快于治疗组。结论 r-Caspase-3具有自催化凋亡诱导活性，以r-Caspase-3为目的基因的基因治疗可能为治疗胰腺癌以及其它恶性肿瘤开辟新的途径。     

VEGF-C基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的影响

目的探讨将真核表达载体pcDNA3．1-VEGF—C重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞后VEGF-C表达的变化。方法通过脂质体介导方法，将构建好含有VEGF—C的重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中，新霉素（G418）筛选得到稳定转染细胞系，RT—PCR和Western blot方法检测稳定转染后细胞中VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果成功转染并获得稳定高表达VEGF—C的乳腺癌MCF-7细胞系，其转染组VEGF—C mRNA相对吸光度值（12．382&#177;2．183）较空载组（6．039&#177;1．950）显著上调（P〈0．01）。Western blot检测转染组VEGF-C蛋白相对灰度值（0．971&#177;0．186）较空载组（0．594&#177;0．196）明显上调（P〈0．05）。结论脂质体介导重组质粒pcDNA3．1-VEGF-C转染入人乳腺癌MCF7细胞中可显著增加VEGF—C表达水平。     

瘤体内直接注射白细胞介素-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应的研究

目的 观察瘤体内直接注射白细胞介素(IL)-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应.方法 构建IL-7真核表达质粒(pcDNA3-IL-7);建立乳腺癌TM40D细胞BALB/C小鼠移植模型;瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7,观察小鼠肿瘤体积变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测外周血干扰素(IFN)-γ含量;流式细胞仪检测胞内IFN-γ的分泌量;局部肿瘤经治疗后行常规病理分析.结果 成功构建pcDNA3-IL-7;与对照磷酸盐缓冲液(PBS)组(115.2±11.8) ng/L、pcDNA3组(133.6±9.4) ng/L比较,pcDNA3 -IL-7注射组(242.3±10.1)ng/L外周血IFN-γ明显增高;pcDNA3-IL-7明显抑制肿瘤生长(P＜0.05);流式细胞仪检测显示pcDNA3-IL-7显著促进CD4+T细胞、CD8+T细胞内IFN-γ的分泌量;常规病理显示pcDNA3 -IL-7注射组肿瘤组织大量坏死,炎性细胞和大量淋巴细胞浸润.结论 瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7明显抑制小鼠乳腺肿瘤生长,显著促进IFN-γ分泌,增强了小鼠机体抗乳腺肿瘤的免疫效应.     

HCCR-2反义核酸对肝癌HepG2细胞的作用

目的 研究反义HCCR-2真核表达载体对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.方法 构建反义HCCR-2真核表达载体(反义载体组),转染肝癌HepG2细胞,G418筛选阳性克隆,同样方法获得空载体pIRES2-EGFP稳定表达的细胞株(空载体组),取肝癌HepG2细胞为对照(肝癌HepG2组),用MTT法、流式细胞仪、透射电镜观察反义HCCR-2转染前后肝癌HepG2细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡及细胞形态的变化.采用单因素方差分析和χ2检验比较各组差异.结果 反义载体组、空载体组、肝癌HepG2组HCCR-2 mRNA表达水平分别为0.39±0.04、0.62±0.06、0.72±0.03,3组比较差异有统计学意义(F=43.701,P<0.05);细胞凋亡率分别为13.30%、2.51%、2.07%,反义载体组与空载体组、肝癌HepG2组比较,差异有统计学意义(χ2=6.793,8.721,P<0.05);反义载体组细胞生长减慢,阻滞于G0/G1期.结论 HCCR-2反义核酸真核表达载体能抑制HCCR-2 mRNA的表达,促进细胞凋亡,HCCR-2蛋白可能参与肝癌细胞的周期调控,并与细胞的生长增殖有关.     

熊果酸对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响

目的 观察熊果酸对MCF-7乳腺癌细胞增殖、凋亡、细胞侵袭及裸鼠移植瘤生长的影响.方法 将1、10、100 μmol/L的熊果酸分别作用于乳腺癌MCF-7细胞12、24、48 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力变化及生长抑制率,流式细胞术及Transwell小室法检测熊果酸作用48h时MCF-7细胞周期、细胞凋亡率及细胞侵袭力.将乳腺癌MCF-7细胞接种于裸鼠,成瘤后分为生理盐水对照组、熊果酸低剂量组(每日1 mg/kg)、中剂量组(每日5 mg/kg)和高剂量组(每日25 mg/kg),检测5、10、15 d裸鼠移植瘤体积、肿瘤生长抑制率及15 d时肝肾功能、血常规变化.结果 随熊果酸浓度增加及作用时间延长,MCF-7细胞生长及凋亡发生受到显著影响,100 μmol/L熊果酸作用48 h时,细胞生长抑制率为46.0%,生长周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率为(16.48±2.46)%,细胞侵袭力显著下降.熊果酸组裸鼠移植瘤体积显著小于对照组,15 d时熊果酸高剂量组肿瘤体积为(323.5±33.5)mm3生长抑制率为50.9%.各组肝肾功能和血常规无明显变化.结论 熊果酸可引起体外乳腺癌McF-7细胞增殖抑制、细胞凋亡率增加及细胞侵袭力下降,可显著抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长.