环介导同温扩增检测全血日本血吸虫DNA的研究

目的建立一种检测全血标本中日本血吸虫DNA的环介导同温扩增(LAMP)方法。方法选择日本血吸虫基因组重复序列DNA SjR2(839~1 138 bp、563~764 bp)、SjSH7(204~399 bp)和Sj-nonLTR1(1 678~1 877 bp)的4段DNA序列作为扩增片段,根据LAMP原理设计合成4组引物,通过对此4组引物用于DNA LAMP扩增的敏感性和特异性进行比较分析和检测条件的优化,建立特异、敏感,可用于检测全血日本血吸虫DNA的LAMP方法。应用此方法对10只日本血吸虫感染前及感染后不同时间同一家兔的配对全血DNA进行扩增,观察其应用价值。结果 4组引物中,以日本血吸虫SjR2(839~1 138 bp)作为扩增靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株(检出限为10-4ngDNA)、菲律宾株和曼氏血吸虫的基因组DNA,人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、疟原虫基因组DNA不能扩增。以Sj-nonLTR1(1 678~1 877 bp)为靶片段,LAMP扩增无特异性。以SjR2(563~764 bp)和SjSH7(204~399bp)为靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株基因组DNA(检出限为10-6ng和10-3ng)及菲律宾株基因组DNA,人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、曼氏血吸虫基因组DNA和疟原虫基因组DNA不能扩增。用SjR2(839~1 138 bp)引物对10只日本血吸虫感染兔不同时间的配对全血标本进行扩增,感染前血样均为阴性,感染后连续5周全血基因组DNA的浓缩标本均为阳性,非浓缩标本部分阳性。结论本研究建立了检测兔全血日本血吸虫兔基因组DNA的LAMP方法。该方法对浓缩DNA标本的检出效率高于非浓缩标本,具有血吸虫感染早期诊断价值。     

环介导同温DNA扩增技术快速检测弓形虫DNA的初步研究

目的 建立一种快速的弓形虫活动性感染检测方法. 方法 根据刚地弓形虫特异性基因B1的基因序列设计一套用于环介导同温DNA扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,用DNA聚合酶Bst在65 ℃水浴箱中对含有弓形虫基因组DNA的样本进行LAMP扩增,用荧光染料SYBRⅡ染色及琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色观察结果.同时进行常规PCR对照试验. 结果 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色发现LAMP扩增产物为大小不等的DNA片段,在扩增产物中加入荧光素SYBRⅡ顔色由紫红色变成绿色荧光,而阴性对照管仍保持紫红色.环介导同温DNA扩增的敏感性为103个弓形虫/ml, 高于常规PCR. 结论 LAMP扩增检测弓形虫DNA的方法已经建立,为发展弓形虫病快速诊断方法奠定了良好的基础.     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能评价

目的 评价重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能.方法 采用群体法检测.每50只钉螺作为1个检测样本,阴性样本不含感染性钉螺,阳性样本含不同数量感染性钉螺.设置阴性样本10个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各10个...     

血吸虫病传播阻断地区环介导等温扩增技术检测钉螺血吸虫感染性效果

目的　比较环介导等温扩增技术（LAMP）和镜检法在血吸虫病传播阻断地区检测血吸虫感染性钉螺的效果,为该类地区优化钉螺监测技术提供科学依据。方法　选择云南省鹤庆县达到传播阻断标准的新庄、古乐、邑头、连义4个山丘型血吸虫病流行村作为研究村,其中新庄、古乐为山区村,连义、邑头为坝区村。2018年7月采用系统抽样结合环境抽查法进行钉螺调查,捕获钉螺用解剖镜检法观察血吸虫感染。同时在各有螺环境捡获的钉螺镜检后随机选择10 ~ 20只进行组织提取,按不同环境分别编号,混合后进行LAMP检测。比较不同流行村环境LAMP阳性率差异。结果　4个村共调查83处有螺环境,捕获活螺7 949只,镜检未发现血吸虫感染性钉螺。1 786只钉螺共混合成226管样品进行LAMP检测,在2个坝区村发现LAMP核酸阳性3管,分布在2个村3处有螺环境,其中连义村1处环境,环境阳性率5.89%;邑头村2处环境,环境阳性率14.29%,2个坝区村环境阳性率差异无统计学意义（P = 0.344）,但坝区村环境总阳性率（9.67%,3/31）高于山区村（0）（P = 0.048）。结论　LAMP技术检测血吸虫感染性钉螺较传统解剖镜检法更敏感,可作为山丘型血吸虫病传播阻断流行区高危有螺环境钉螺检测方法的一种补充。     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测 日本血吸虫感染性钉螺

目的　建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光（Recombinase aided amplification,RAA）法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法　将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果　建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39 ℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后, 荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论　成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。     

浙江开化县应用LAMP技术检测感染性钉螺的效果分析

目的 对环介导等温扩增（ｌｏｏｐ － ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ,ＬＡＭＰ） 技术检测感染性钉螺的条件进行优化,并评估其在浙江开化县感染性钉螺检测的应用。 方法 优化 ＬＡＭＰ 反应条件,建立基于ＬＡＭＰ 方法的血吸虫感染性钉螺的检测方法,并用于开化县的钉螺监测。 对传统压碎镜检法与 ＬＡＭＰ 法进行比较。 结果 引物 ０２ － ＳｊＲ２８ 为最优引物、６５℃ 为最优反应温度、７． ８ ｍＭ 为最优 Ｍｇ２ ＋ 浓度。 ＬＡＭＰ 技术检测结果与压碎镜检法鉴定结果完全相符;ＬＡＭＰ 法与压碎镜检法相比,结果观察方便,定性可靠,大规模筛查快速,但存在费用高,少量钉螺检测试验耗时长,设备携带不方便,专业要求高,定量有缺陷等不足。 结论开化县建立 ＬＡＭＰ 方法用于感染性钉螺的检测,是一种有效、能切实在防治工作中应用的血吸虫病防治检测手段,目前适用于大规模实验室筛查。     

重组酶介导核酸等温扩增荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的研究北大核心CSCD

目的探索重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的可行性。方法用日本血吸虫毛蚴人工感染200只湖北钉螺,随机分为阳性对照组和实验组各100只,另取100只未感染钉螺作为阴性对照组。将阳性对照组钉螺饲养至70 d,通过逸蚴法观察感染情况并计算阳性率。实验组钉螺分别在3 h以及5、20、40、70 d随机取20只,压碎镜检,同时提取钉螺软体DNA,进行荧光RAA法检测,获得不同时间点的阳性率,并与阳性对照组相比较。通过二代测序法对RAA检测阳性的特异性扩增产物进行测序鉴定。结果毛蚴感染后3 h、5 d、20 d、40 d、70 d实验组钉螺RAA法检测阳性率分别为60%、60%、65%、60%、70%,压碎镜检的阳性率分别为0、0、0、15%、65%,除70 d外其余时间点两种检测方法的阳性率差异均有统计学(χ^2=17.14,χ^2=17.14,χ^220 d=19.26,χ^2=8.64,均P<0.01);各时间点间阳性率差异无统计学意义(χ^2=0.68,P>0.05),各时间点阳性率与阳性对照组阳性率64.6%比较差异均无统计学意义。RAA扩增产物经二代测序后与数据库比对,确认为血吸虫特异性基因片段。结论 RAA荧光法敏感、特异,可用于日本血吸虫感染性钉螺的早期检测。     

环介导等温扩增技术检测日本血吸虫尾蚴的实验研究

目的建立一种检测日本血吸虫尾蚴的方法。方法采用环介导等温扩增技术（LAMP）：使用基因释放剂快速提取尾蚴基因组DNA,设计4条扩增尾蚴钙结合蛋白基因的LAMP引物,进行LAMP反应,以华支睾吸虫为阴性对照,LAMP产物经显色、电泳鉴定。用细吸管在解剖镜下分别吸取20、10、5、1条尾蚴进行LAMP反应,检测其敏感性。结果尾蚴检测管经显色后呈绿色（阳性）,对照组呈棕色（阴性）。尾蚴LAMP产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增产物。LAMP可检测到尾蚴的最低数量为1条。结论LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测日本血吸虫尾蚴。     

日本血吸虫人工与自然感染性钉螺对小鼠的感染性

目的探讨人工培育与自然感染的日本血吸虫感染性钉螺对小鼠感染性的差异。方法将120只昆明种小鼠随机分为2组,将人工与自然感染性钉螺用常规法逸蚴,每只小鼠感染40条尾蚴,以平均虫荷、成虫发育率、每克肝脏虫卵数(肝卵EPG)和每克粪便虫卵数(粪卵EPG)为指标进行观察,并对观察结果进行统计分析。结果自然感染性钉螺感染小鼠的平均虫荷、成虫发育率、肝卵EPG及粪卵EPG分别为27.43±3.78、68.53±9.44、19 800.97±6 752.59、196.37±11.56,均明显高于人工组的23.93±4.93、59.83±12.32、5 803.69±1 560.49、107.73±10.32(P均<0.05);相同数量的尾蚴感染后,雄性组小鼠的虫荷、发育率、肝卵EPG均高于雌性组(P均<0.05)。结论自然感染性钉螺对小鼠的感染性明显高于人工感染性钉螺,且雄性小鼠比雌性小鼠更易感染血吸虫尾蚴。     

快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒的建立及应用

目的构建快速检测日本血吸虫感染性钉螺环介导同温DNA扩增（LAMP）试剂盒,用于血吸虫病流行区感染性钉螺调查。方法采用碱裂解法制备钉螺基因组DNA样品,以缩短检测过程中样品DNA制备时间;对LAMP试剂进行组合优化,采用染料显色方法判定LAMP结果,以减少LAMP检测的操作步骤,避免污染,减少假阳性结果产生;建立批量检测钉螺的LAMP方法,以适用于血吸虫病防治现场大规模钉螺筛查与有感染性钉螺地块的调查。将以上优化技术及试剂整合成快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒。结果制备的日本血吸虫感染性钉螺LAMP检测试剂盒可用于血吸虫流行区现场钉螺快速检测,检测时间可由原来的6h缩短为2h,方法的灵敏性与常规LAMP法相似。该试剂盒能检测出感染后1周钉螺,能对现场钉螺进行大批量检测。结论建立的LAMP试剂盒用于日本血吸虫感染性钉螺检测快速、特异、操作简便,适用于日本血吸虫病流行区感染性钉螺调查。     

钉螺感染日本血吸虫后酸性磷酸酶含量变化

目的 观察钉螺感染日本血吸虫后酸性磷酸酶(ACP)含量的变化.方法 以软组织挤压法获取感染性钉螺与阴性钉螺血淋巴细胞涂片,分别对2组钉螺血淋巴细胞进行ACP组织化学染色,用显微镜观察其活性变化.结果 感染性钉螺淋巴细胞中ACP含量增加,明显高于阴性钉螺.结论 ACP可能在钉螺感染日本血吸虫毛蚴的防御中发挥作用.     

钉螺人工群体感染血吸虫时间的优化

目的 目的 探讨钉螺人工群体感染血吸虫的优化时间。方法 方法 在实验室条件下, 采用日本血吸虫毛蚴分别感染钉螺 2、 3、 4 h 3组, 观察感染60～120 d后各组钉螺死亡率、 钉螺感染率及尾蚴获得量, 分析各组3个指标的差异, 以钉螺死亡率 相对低、 钉螺感染率和尾蚴获得量相对高的钉螺感染时间为最优时间。结果 结果 3 h感染组60 d的钉螺感染率显著高于其他 组 （P＜0.05）, 钉螺死亡率低于其他组 （P＜0.05）, 60～120 d的尾蚴获得量显著高于2 h感染组 （P＜0.05）, 与4 h感染组差异 无统计学意义 （P＞0.05）。结论 结论 实验室条件下, 血吸虫毛蚴人工群体感染钉螺3 h为相对优化的感染时间。     

钉螺对不同宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性

目的了解钉螺对不同终宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性差异。方法收集家兔、水牛和小白鼠排出的虫卵,孵出毛蚴,以毛蚴和钉螺5：1的比例感染同一地钉螺。同时设对照组,观察各组钉螺感染率、死亡率。结果实验组家兔、水牛和小白鼠排出虫卵孵出毛蚴感染钉螺,获得的阳性率分别为1.42%、8.67%和19.87%,钉螺死亡率分别为29.5%、13.5%和24.5%;对照组钉螺阳性率分别为2.63%、2.02%和11.66%,死亡率分别为24.0%、49.5%和18.5%。结论不同宿主源日本血吸虫毛蚴对钉螺易感性存在差异。     

重组酶聚合酶扩增结合电化学DNA传感器检测日本血吸虫方法的建立

目的联合重组酶聚合酶扩增及电化学DNA传感器检测技术,建立一种敏感、特异且简单的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核酸检测方法。方法提取日本血吸虫基因组DNA,以Sj R2基因片段为靶序列,设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物与探针,与电化学DNA传感器(EC)检测技术联合,将探针固定于多通道电极芯片进行界面RPA扩增及电化学检测,建立日本血吸虫核酸等温检测方法。优化RPA反应条件,通过检测10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8ng日本血吸虫基因组DNA,评价RPA-EC方法的敏感性;通过检测10 ng日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫及华支睾吸虫的基因组DNA,评价RPA-EC方法的特异性。取10只6~8周龄C57成年小鼠,每鼠经腹部贴片感染40条日本血吸虫尾蚴,分别于感染前(0 d)和感染后7、21、35 d收集尾静脉血清,验证RPA-EC方法检测感染动物动态血清DNA中Sj R2基因片段的可行性。结果RPA-EC联合检测方法可在37℃、30 min内完成SjR2基因片段的界面快速扩增及检测,成虫基因组DNA的最低检出限可达10^-8ng,与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫及华支睾吸虫基因组DNA无交叉反应,具有较好的特异性。日本血吸虫感染小鼠实验结果显示,RPA-EC联合检测方法可高敏感检出感染后7、21、35 d等不同感染期小鼠血清中的SjR2基因片段。结论本研究所建立的RPA-EC联合检测方法敏感性高、特异性好、操作简便,具有一定的应用前景。     

重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

目的 建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（RAA）。方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应（PCR）同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果 建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论 本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。     

感染性钉螺在北方水域对动物宿主的易感性

目的 探索输入性感染性钉螺在北方非疫区水域感染人畜的可能性.方法 选择南水北调水利枢纽微山湖区作为研究现场,以南水北调东线工程干渠南端取水口地区江滩的感染性钉螺,感染动物宿主小白鼠30只和家兔3只;采用毛蚴孵化法粪检和解剖实验动物,观察肝脏虫卵结节的方法以确定感染情况.结果 感染后第2～4周,存活的19只小白鼠肝脏均有虫卵结节,感染成功率为100%;感染后第7周,家兔毛蚴孵化法粪检血吸虫卵均为阳性,解剖见肝脏均有虫卵结节.结论 输入性感染性钉螺在北方非疫区自然水域具有逸出尾蚴并感染动物宿主的能力.