Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

GFP转基因鼠胚胎神经上皮 干细胞的体外培养

目的观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）转基因鼠来源的胚胎神经上皮干细胞体外增殖和分化的情况。方法将来源于孕11dGFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞与普通大鼠神经上皮干细胞进行体外培养,比较二者克隆增殖、分化的状况。结果GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞可在体外进行克隆增殖,并能分化为神经元和神经胶质细胞,与普通鼠神经上皮干细胞比较没有差异。结论GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞可在体外克隆及分化,并能稳定地表达绿色荧光蛋白。     

APP5肽模拟物P165对体外培养大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的 研究一种小分子多肽─APP5肽的模拟物P165对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响,以期能找到一种可代替神经营养因子的小分子物质,能够促进NSCs的增殖或分化,为将来的临床应用提供理论依据.方法 (1)原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs; (2)利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2,3-环核苷酸-3磷酸二酯酶(CNPase)对培养的NSCs进行鉴定;(3)将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和P165组, 观察各组细胞形态的变化;(4)将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和P165组,利用细胞计数,测定干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小的方法分析P165对海马NSCs增殖的影响.结果 (1)海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或CNPase阳性; (2)海马NSCs加入P165及其反序列后细胞形态上与对照组相比没有明显改变;(3)与对照组相比,加P165后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异.结论 P165能够促进海马NSCs的增殖,但并不促进其分化.     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的：建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点。方法：利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察。采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果：从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象。贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞。结论：用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能。     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点.方法利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察.采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象.贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能.     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及鉴定

目的:体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞,观察其生长、增殖和分化特点.方法:利用倒置显微镜、MTT法、免疫细胞化学等方法检测神经干细胞的增殖、分化情况.结果:分离的脊髓神经干细胞呵形成大量悬浮的神经球,并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈nestin阳性.在添加10%胎生血清7 d后,神经球细胞可分化为有神经元、星形胶质细胞特异性抗原表达的细胞.结论:体外培养大鼠胚胎脊髓可得到大量神经干细胞,并能分化为神经元和星形胶质细胞.     

胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖与分化的实验研究

目的观察胚胎神经上皮干细胞在体外克隆增殖和诱导分化的情况。方法取孕11 d大鼠的胚胎,经分离获得神经管上皮细胞,在无血清培养基内克隆、增殖、传代。取不同时期的神经球进行神经干细胞的鉴定和诱导分化,并通过免疫组织化学染色鉴定分化的结果。结果胚胎神经上皮干细胞在体外能够克隆、增殖,形成的神经球呈nestin阳性,在分化培养基内可分化为星型胶质细胞和神经元。结论胚胎神经上皮干细胞可在体外进行单细胞克隆和诱导分化。     

均一的成人骨髓源性神经干细胞的简捷获取

目的 探讨建立具均一性的、未分化且具有神经分化能力的成人骨髓源性神经干细胞（human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs）的有效获取方案。方法 抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells, hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为Md-NSCs,以诱导培养基于体外诱导培养Md-NSCs向神经系细胞分化;相差显微镜下观察 hMSCs及Md-NSCs的形态学特征;免疫组化法检测Md-NSCs中Nestin的表达,以及由 Md-NSCs诱导分化后得到的神经系细胞中GFAP、NG2及MAP2ab的表达。结果 传代纯化后的hMSCs呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛。经10~15d诱导培养,hMSCs可分化为Md-NSCs,其形态为均一性的、呈球形的细胞克隆,不贴壁生长,增殖旺盛,并聚集成神经球结构,Md-NSCs克隆高度表达神经干细胞标志蛋白Nestin。经7~10天诱导培养,Md-NSCs于体外可分化成神经系细胞,分化细胞可表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP、少突胶质细胞标志蛋白NG2及神经元细胞标志蛋白MAP2ab。 结论 通过本方案可简捷有效地获得均一的成人骨髓源性神经干细胞,可为体内移植治疗人类神经系统疾病提供丰富而理想的神经干细胞来源。     

外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖、分化作用的初步研究

目的 探讨外源性神经节苷脂(GM1)对从胎鼠大脑分离培养的神经干细胞(NSCs)增殖及分化的作用.方法 ①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮层和海马分离培养原代细胞,加血清诱导其分化.②在NSCs培养基和DMEM/F12培养基中加入不同浓度的GM1,观察GM1对NSCs增殖和分化的影响.结果 ①与不含GM1的NSCs培养基相比,在NSCs培养基中加入低浓度的GM1,NSCs的生长无明显改变,随着GM1浓度的增加,NSCs克隆球体积逐渐减小,细胞逐渐死亡;②在DMEM/F12培养基中单独加GM1而不加血清,NSCs克隆球均未见继续生长,也未见分化,而是迅速的死亡.结论 在NSCs培养基中,低浓度(12.5 μg/mL)GM1对NSCs的增殖无明显影响,但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用;在无血清的DMEM/F12培养基中,GM1不能诱导NSCs分化.     

新生树鼠句海马神经干细胞的体外培养与鉴定

目的 分离培养树鼩海马神经干细胞,并对其进行鉴定.方法 应用加有B27添加剂、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的培养液对新生树鼩海马部脑细胞进行体外培养,并进行传代.采用免疫组织化学及免疫荧光法对培养细胞的Nestin抗原进行鉴定.结果 从新生树鼩海马部分离的细胞可连续传代和不断增殖形成神经球,神经球在含血清培养基中具有多向分化能力,Nestin表达阳性.结论 采用特定的培养液可以在体外培养树鼩海马神经干细胞.     

心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

目的初步探讨心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化作用的影响。方法分离新生SD大鼠海马组织,采用无血清及单克隆培养方式获得大量神经干细胞,将不同浓度心脉隆注射液加入第3代神经干细胞单细胞悬液中有血清贴壁培养并分实验组和对照组,应用免疫荧光及细胞化学染色检测Nestin、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、微管相关蛋白2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,计算MAP-2阳性细胞百分率。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察心脉隆注射液对神经干细胞增殖能力的影响。结果海马NSCs在分化后,各心脉隆注射液干预组MAP-2阳性细胞比例均较空白对照组增高(P<0.05),MTT结果显示培养5 d后各药物组NSCs增殖能力均较对照组增强(P<0.05)。结论心脉隆注射液具有促进神经干细胞增殖并向神经元方向分化的作用。     

人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。     

C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外分离、培养神经干细胞（NSCs）,并对其进行鉴定。方法采用手动法及胰蛋白酶消化法分离胎鼠脑细胞,用优化的无血清NSCs培养基进行培养。细胞免疫荧光法检测NSCs特异性标记分子的表达。结果分离的脑细胞体外培养48 h已大部分贴壁,3 d左右获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团。第3代时,很少见到贴壁细胞,几乎全是神经球,神经球周围存在较多微刺。细胞表达一种中间丝蛋白,即巢蛋白（nestin）。结论成功分离、鉴定出C57小鼠NSCs,并可在体外条件下进行传代扩增培养。     

大鼠胚胎神经干细胞培养方法的比较

用多种方法培养大鼠胚胎神经干细胞并诱导其分化 ,应用相差显微镜和免疫荧光染色方法对其进行观察和比较。发现在培养液中同时加入bFGF和EGF ,并采用较高的细胞种植密度 ,干细胞增生速度最快。提示 2种神经生长因子对加快干细胞的增生具有协同作用 ,适当提高干细胞的种植密度可加快其增生速度     

缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:随机选取新生1天(Q1组)、新生7天(Q7组)、新生14天(Q14组)大鼠各6只,分别缺氧2小时.将各组大鼠海马在无血清培养液中,进行原代、单克隆和传代培养;单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色;传三代细胞诱导分化3d后...     

胎牛血清对胎鼠神经干细胞分化的影响

目的探讨胎牛血清对神经干细胞（neural stem cells,NSCs）分化结果的影响．方法通过无血清培养的方法,将胎鼠大脑皮质进行原代培养所获得的神经干细胞克隆传代纯化后,分别接种在加入DMEM／F12＋B27和DMEM／F12＋B27＋5％FCS两种不同培养基的培养皿中诱导分化,9d后行免疫荧光细胞化学染色,用抗体β—Tubulin Ⅲ、GFAP、GalC鉴定分化细胞,并观察其形态特点．结果成功分离获得NSCs,并具有分化为神经元和胶质细胞的能力;在相同时间内含血清培养基中的细胞球分化快而充分,且分化结果不同．结论血清可促进NSCs分化并影响分化结果．