沉默激酶功能区受体抑制前列腺癌PC-3细胞的裸鼠体内成瘤能力

目的 研究激酶功能区受体(KDR)基因表达沉默后对前列腺癌PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响.方法 将15只5周龄BALB/c雄性裸鼠随机分为干扰组、阴性质粒组和未转染组,每组5只.分别接种构建的pSilencer 3.1-KDR siRNA表达质粒转染PC-3细胞、阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞以及未转染的PC-3细胞于裸鼠皮下;观察各组PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率、瘤体生长速度以及平均瘤质量等方面的变化,RT-PCR和Western blot技术检测瘤体KDR基因和蛋白表达.结果 pSilencer3.1KDR质粒转染组的裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组;与未转染组和PSilencer3.1-NC组相比,pSilencer3.1-KDR组肿瘤的生长受到明显抑制,平均体积较小(0.28 cm3 vs 0.721 cm3,0.715 cm3,P＜0.01),平均瘤质量较轻(0.14g vs 0.648g,0.635g,P＜0.01);裸鼠肿瘤组织中KDR mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 RNAi介导的KDR基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内的瘤体生长速度,KDR有可能成为肿瘤治疗的新靶点.     

沉默KDR基因乳腺癌MCF-7细胞的生物学特征改变

背景：随着基因工程以及肿瘤生物分子学等新兴学科的发展壮大,基因治疗肿瘤成为一种新的治疗模式。 目的：探讨KDR基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖能力和侵袭能力的影响。 方法：设计针对KDR基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列,转染人乳腺癌MCF-7细胞,应用RT-PCR及Western blot法检测沉默KDR基因后MCF-7细胞KDR mRNA及蛋白的表达;应用流式细胞仪、CCK-8 增殖实验、小室侵袭实验检测沉默KDR基因后乳腺癌MCF-7细胞的细胞周期、增殖能力、侵袭能力的变化。 结果与结论：KDR基因沉默48 h后,乳腺癌MCF-7细胞KDR mRNA及蛋白表达明显降低;乳腺癌MCF-7细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,细胞增殖得到显著抑制,穿过滤膜的细胞数量明显减少。上述结果表明沉默KDR基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭能力得到明显抑制,说明KDR基因沉默可能成为新的有效治疗乳腺癌的靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

下调VEGF基因表达对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用

目的利用RNA干扰技术特异性抑制乳腺癌细胞MCF-7的VEGF基因表达,研究乳腺癌的治疗新方法.方法体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGF mRNA的siRNA,使用脂质体转染的方法导入细胞,观察转染后乳腺癌细胞MCF-7的增殖变化,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA检测蛋白表达的下降效果.结果所设计的两个靶位点siRNA能有效抑制乳腺癌细胞生长;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低.阴性对照的错义序列组siRNA则没有这种效果.结论应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤细胞的增殖.     

siRNA抑制SKOV-3细胞Her2/neu表达及细胞增殖的动物实验研究

目的:通过卵巢癌细胞株SKOV-3细胞增殖及动物荷瘤实验探讨siRNA沉默Her2/neu基因的表达效果.方法:靶向Her2/neu的siRNA经脂质体LipofectAMINE2000介导转染到SKOV-3中,通过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her2/neu基因表达的SKOV-3/siRNA细胞株,通过RT-PCR和免疫组化方法检测Her2/neu基因抑制效果,运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组细胞增殖水平并将SKOV-3/siRNA细胞接种到裸鼠皮下检测荷瘤情况.结果:建立了稳定抑制Her2/neu基因表达的细胞株SKOV-3/siRNA,RT-PCR和免疫组化结果显示Her2/neu基因表达受到较强抑制,MTT检测结果显示SKOV-3/siRNA组细胞增殖较SKOV-3明显下调(P＜0.05),其接种在裸鼠皮下形成的肿瘤生长速度明显减慢(P＜0.05).结论:靶向Her2/neu基因的siRNA可以抑制卵巢癌细胞株SKOV-3在体外和体内增殖,有望成为卵巢肿瘤治疗的新途径.     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κBp65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景。利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κBp65的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染入小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κBp65mRNA表达,Westernblot检测细胞内NF-κBp65蛋白水平。同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用。结果显示:在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κBp65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κBp65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κBp65的表达也明显受到抑制。说明RNAi技术可以抑制NF-κBp65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法。     

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的：研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组：空载对照组（对照组）和不同浓度（3.125、6.25和12.5 nmol/L）的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞，以实时定量PCR检测结肠癌细胞Cripto mRNA，分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞，接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠，收集裸鼠肿瘤组织，对组织VEGF进行免疫组化染色，计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示，转染组Cripto mRNA被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF 蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示，转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达，可抑制结肠癌组织血管生成。     

RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

iASPP对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响

目的： P53凋亡刺激蛋白（ASPP）家族成员能够调节P53诱导的细胞凋亡。其中ASPP家族抑制成员(iASPP)主要通过特异性地和P53蛋白结合抑制肿瘤细胞的凋亡,本实验通过构建iASPP的RNAi质粒,研究在体内外抑制iASPP基因后对表达野生型p53基因的乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响。方法: 采用分子生物学方法构建iASPP的腺病毒RNAi质粒pAd-iASPP-RNAi;体外转染MCF-7细胞,同时建立MCF-7细胞的裸鼠移植瘤模型;分别采用RT-PCR和Western blotting检测转染后瘤细胞iASPP mRNA和蛋白质表达的变化;采用流式细胞术检测转染前后瘤细胞凋亡的变化。结果: 转染iASPP RNAi后,MCF-7细胞的iASPP mRNA及蛋白表达量降低（抑制率分别为95.4%和96.8%,P<0.01）;MCF-7细胞的凋亡百分率、坏死百分率与对照组相比具有显著差异（P<0.01）。裸鼠移植瘤模型经pAd-iASPP-RNAi处理后,iASPP mRNA及蛋白表达量也明显降低（抑制率分别为87.4%和89.2%,P<0.01）;移植瘤细胞的凋亡百分率和坏死百分率显著上升（P<0.01和P<0.05）。结论: 在体内外抑制iASPP基因的表达能够通过p53途径诱导表达野生型p53的乳腺癌细胞凋亡。     

siRNA抑制胃癌细胞BGC-823及裸鼠皮下移植瘤中生存素的表达

目的： 探讨RNA干扰用于胃癌治疗的可行性与特异性。方法: 设计靶向生存素基因的小干扰RNA,并导入胃癌BGC-823细胞株和裸鼠皮下移植瘤,在体内、外诱导RNA干扰,采用MTT、流式细胞检测技术、RT-PCR法、Western bloting、免疫组织化学和TUNEL检测survivin基因表达、细胞周期和细胞凋亡。结果: 重组质粒pTZU6+1-siRNA- survivin导入BGC-823后,survivin mRNA和蛋白表达均明显下调;细胞生长被抑制,细胞周期中S期细胞减少, G1/G0期细胞增加,出现明显细胞凋亡。裸鼠皮下移植瘤体积明显缩小,Survivin表达均下调。体内、外对照组各指标均无明显变化。 结论: RNA干扰明显抑制靶基因survivin在胃癌细胞BGC-823及裸鼠皮下移植瘤中的表达及肿瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡,且特异性好,可能成为肿瘤治疗的新方法。     

RNA干扰Skp2基因抑制T47D乳腺癌细胞生长

目的构建S期激酶相关蛋白2（skp2）RNA干扰真核细胞表达载体,研究skp2基因沉默对乳腺癌T47D细胞生长的抑制作用。方法应用Ambion公司在因特网上的设计程序设计小干扰RNA。构建3个不同的重组体转染T47D细胞,RT-PCR和Western Blotting检测skp2基因表达,细胞计数分析Skp2RNA干扰对肿瘤细胞增殖的影响。结果重组体经PCR和测序证实准确连接。转染重组体的细胞skp2的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降。重组体转染的细胞增殖明显降低。结论用RNA干扰下调skp2表达抑制乳腺癌细胞生长,skp2可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。     

应用RNAi技术沉默STAT3基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的 探讨应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3（STAT3）基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响。方法 应用RNAi技术，以psilencer1．0-U6-STAT3-siRNA重组质粒体外转染MCF-7细胞，采用MIT实验、流式细胞仪检测MCF-7转染前后细胞增殖、细胞周期和早期凋亡的变化，通过Western blotting及半定量RT-PCR检测STAT3基因不同水平的表达。结果 MTT实验、流式细胞仪的结果显示，重组质粒转染组的MCF-7细胞的增殖明显受到抑制，且出现凋亡现象；Western blotting及半定量RT-PCR结果显示，重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在蛋白及RNA水平上都显著低于对照组（P〈0．01），而空白对照组及空质粒组无明显差异（P〉0．05）。结论 应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低乳腺癌MCF-7细胞STAT3的表达，进而抑制细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

小干扰RNA沉默hPTTG1基因对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的: 利用RNA干扰技术沉默人垂体瘤转化基因1( hPTTG1 )表达,观察卵巢癌细胞增殖能力和细胞凋亡的改变并探讨分子机制。方法: 化学合成靶定 hPTTG1 的小干扰RNA(siRNA)转染体外培养的A2780细胞,RT-PCR和Western blotting检测 hPTTG1 及c-myc表达水平;MTT法和 -TdR掺入实验检测 hPTTG1 对细胞增殖的影响;annexin V/PI染色流式细胞术和TUNEL法测定各组细胞凋亡情况。结果: hPTTG1 siRNA转染组 hPTTG1 mRNA和蛋白表达下降,抑制率分别为70.5%±3.9%和63.8%±4.5%;转染 hPTTG1 siRNA 24 h细胞吸光度值开始下降,48 h抑制效果最明显,抑制率为42.9%±5.2%;转染 hPTTG1 siRNA后细胞 -TdR放射性计数明显低于空白组和阴性对照组; hPTTG1 siRNA干扰组细胞存活率下降,细胞凋亡率和坏死率均增加;TUNEL染色分析结果可见 hPTTG1 siRNA干扰组凋亡指数明显高于空白组和阴性对照组; hPTTG1 干扰后c-myc mRNA和蛋白表达均下调。结论: hPTTG1 siRNA通过下调c-myc表达抑制A2780细胞增殖,诱导细胞凋亡, hPTTG1 可作为卵巢癌基因治疗的候选靶点。     

RNA干扰CREB对缓激肽作用的胶质瘤细胞IL-1β分泌的影响

目的探讨转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的磷酸化是否介导了缓激肽刺激大鼠C6胶质瘤细胞内白细胞介素-1β(IL-1β)的表达。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,以CREB为靶基因,将体外化学合成的CREB序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)和无关序列的siRNA分别与Lipofectamine2000结合后转染细胞,用Western blot分析CREB蛋白的表达水平。利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量技术和放射免疫法分别检测CREB siRNA转染前后,缓激肽诱导C6胶质瘤细胞IL-1βmRNA及细胞培养上清液中IL-1β的表达水平。结果CREB序列特异性siRNA转染细胞72h后,可较强的抑制CREB蛋白的表达,而无关序列的siRNA对CREB蛋白表达水平无明显的抑制作用。RT-PCR和放射免疫法结果均显示CREBsiRNA干预C6细胞后,并未改变缓激肽刺激IL-1β表达的能力。结论化学合成的siRNA可有效抑制C6胶质瘤细胞中CREB的表达,CREB可能未参与缓激肽刺激C6细胞IL-1β表达的信号转导过程。     

NEK2基因沉默促进卵巢癌细胞SKOV3凋亡

目的研究siRNA干扰NEK2表达对卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法设计合成3条对NEK2的siRNA,转染进SKOV3细胞,采用real-time PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的NEK2-siRNA序列,进行后续实验;分别采用MTT和流式细胞学技术检测细胞增殖和凋亡,用Western blot检测BAD、BCL-2和caspase-3的表达。结果 1)RNA干扰序列2对SKOV3细胞NEK2的抑制效果最明显;2)与空白组和阴性对照组相比,NEK2-siRNA转染48 h后,SKOV3细胞增殖能力下降,发生凋亡的细胞增加(P<0.01);3)与空白组和阴性对照组相比,NEK2-siRNA转染48 h后,SKOV3细胞中BAD和caspase-3的蛋白表达上调,而BCL-2的蛋白表达下调(P<0.01)。结论 NEK2-siRNA可能通过沉默NEK2的表达,促进卵巢癌细胞SKVO3的凋亡。