TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

葡萄糖转运蛋白-2逆转录病毒表达载体构建/包装及其鉴定

目的 构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础.方法 质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;转pL-GLUT2-SN至包装细胞系PA317,G418抗性筛选,检测上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆行PCR及RT-PCR鉴定.结果 建立GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;所建稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT2,其最高病毒滴度达7.1×105 CFU/ml,PCR及RT-PCR证实GLUT-2基因整合入其中并稳定表达.结论 成功构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为"人工胰岛β细胞"的构建奠定了基础.     

HSV-tk和H60基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的：构建携带自杀基因HSV-tk和免疫相关基因H60的逆转录病毒载体pIRKS-H60、pIRES-TK和pTK-IRES-H60。方法;以质粒pUC19-H60为模板,用PCR方法扩增H60基因,并亚克隆至pMD18-T载体,构建中介载体pMD18-H60。双酶切质粒pMD18-H60和tgCMV／HyTK,获得H60和TK基因片段,再克隆至逆转录载体pIRES,构建重组载体pIRES-H60和pIRES-TK。然后把HS0基因片段克隆至载体pIRES-TK,构建重组载体pTK-IRES-H60。转染重组载体至包装细胞PA317进行病毒包装,用病毒液感染NIH3T3细胞,检测病毒液的滴度。结果：测序结果显示PCR扩增的H60基因序列正确,重组载体经PCR和酶切鉴定得到相应的基因片段。经筛选得到稳定的产病毒细胞株PA317／pIRES-H60、PA317／pIRES-TK和PA317／pTK-IRES-H60,病毒滴度分别为8×10^4、1×10^5、7．1×10^4cfu／mL。结论：成功构建逆转录病毒载体pIRES-H60、pIRES-TK和pTK-IRES-H60,建立了稳定的病毒细胞株,所产生的假病毒颗粒具备一定的感染力。     

含hTERT基因片段重组逆转录病毒的构建

目的构建含hTERT基因片段的重组逆转录病毒。方法采用RT-PCR法从人白血病细胞株K-562中扩增hTERT基因片段(1590~2540bp),亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN,构建重组质粒pLXSN-hTERT;用脂质体转染的方法将从重组质粒转入PT67细胞,G-418压力筛选获得含hTERT基因片段的重组逆转录病毒细胞克隆;0.22μm微孔过滤抗性克隆上清获得含表达hTERT基因的重组逆转录病毒;WesternBlot检测G-418抗性克隆的hTERT产物的表达。结果PCR扩增的hTERT基因片段与GenBank公布的序列相比仅有2个核苷酸差异,氨基酸序列完全一致;重组病毒的滴度为2.85×105PFU/ml;WesternBlot检测到含hTERT基因片段的重组病毒能够表达出一分子量为37kD的多肽。结论成功构建了表达hTERT基因片段的重组逆转录病毒,为进一步探讨内源性表达hTERT基因产物的树突状细胞能否激发特异性CTL的产生奠定了坚实的基础。     

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体 ,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株 ,为利用去C 末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 :用限制性内切酶从质粒PcJak3(ΔC)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定 ;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G4 18筛选抗性细胞 ,转染的包装细胞包装出病毒粒子 ,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段 ;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G4 18筛选抗性克隆 ,检测出病毒滴度 ;经免疫沉淀 (IP)、SDS PAGE电泳、Westernblotting检测NIH3T3细胞中Jak3(ΔC)的表达情况。结果 :①重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC)酶切和DNA检序均表明已含有 2 796bp的Jak3(ΔC)基因 ;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段 ;③病毒滴度为 1.2～ 2 .0× 10 4CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(ΔC)蛋白 ,其分子量为 10 7KD。结论 :我们已成功构建了去C 末端Jak3重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆 ,为利用Jak3(ΔC)对白血病     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

iNOS基因重组逆转录病毒的包装及高滴度病毒液的制备

目的利用逆转录病毒载体PLXSN介导iNOS基因转染,为逆转录病毒介导的iNOS转基因防治血管移植术后再狭窄的研究奠定实验基础。方法采用QIAGEN plasmid Maxi Kit纯化PLXSN-iNOS;通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSN-iNOS导入包装细胞PA317中;经G418筛选获得抗性克隆,命名为PA317/iNOS;提取抗性克隆细胞基因组DNA,用PCR进行鉴定;用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度。结果PA317/iNOS细胞能稳定合成和分泌重组逆转录病毒颗粒,并在约142 bp处扩增出特异的片段;PLXSN-iNOS病毒上清的最高滴度为1.6×106CFU/mL。结论逆转录病毒载体PLXSN能有效介导iNOS基因的转染。     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

人NT-3重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞系的构建及鉴定

构建并鉴定携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系。方法 :用DNA重组技术将人NT - 3定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN ,并用限制性内切酶进行酶切鉴定 ;磷酸钙转染方法将重组的逆转录病毒转染入包装细胞系PA317,G4 18筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 :构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切开 ,电泳分离显示两条阳性条带 ,分别出现于 0 .8kb和 5 .9kb处 ;重组载体转染包装细胞 ,经G4 18筛选 ,可形成抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 4× 10 5cfu/ml,提示构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论 :构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对神经系统疾病进行基因治疗的方法。     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

分泌高滴度重组人糖皮质激素β受体正义和反义cDNA逆转录病毒细胞系的建立

目的：建立分泌重组人糖皮质激素β受体cDNA的逆转录病毒的细胞系。方法：脂质体介导含人糖皮质激素β受体正义和反义全长cDNA的重组逆病毒质粒分别转染包装细胞PA317，经G418筛选抗性克隆。结果：细胞培养上清液的RT-PCR联合序列分析表明G418抗性PA317细胞克隆能稳定合成并分泌相应的重组病毒颗粒；NIH3T3细胞测定的正、反义cDNA重组病毒滴度分别为2×105 CFU/ml和1.8×105 CFU/ml。结论：成功建立了能分别产生重组hGRβ正义和反义cDNA逆转录病毒的高滴度细胞系，为后续研究工作打下坚实基础。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建

目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA 317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

转FasL基因卵巢癌HO-8910细胞系的建立

目的建立表达转FasL基因卵巢癌细胞系,为以FasL为靶点治疗卵巢癌提供理想细胞模型。方法应用分子克隆技术,将人FasL cDNA片段正向插入逆转录病毒载体pLXSN构建重组质粒pL(hFasL)SN,转染包装细胞PA317收获假病毒上清,磷酸钙法转染卵巢癌HO-8910细胞筛选建系,酶切PCR鉴定、流式细胞仪(FCM)法检测。结果酶切鉴定证实重组质粒pL(hFasL)SN中存在FasL,PCR方法从转染细胞HO-8910-FasL基因组中扩增出0．86kb片段,FCM检测显示FasL表达增加40．32％,HL-60细胞与HO-8910-FasL细胞共培养HL-60细胞凋亡增加25．65％。结论应用逆转录病毒法建立了稳定高表达FasL并具功能的HO-8910-FasL细胞系。     

新抑癌基因PIGl1高表达HepG2细胞株的建立

目的构建人PIGll逆转录病毒载体，建立高表达PIGll基因的HepG2细胞，为进一步研究PIGll基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台。方法将已有的peDNA3，1／NT—GFP—PIGll质粒用PCR法扩增出PIGll片段，构建含人PIGllcDNA的重组质粒pLXSN—PIGll。重组载体经PcR鉴定和DNA测序分析。将该重组质粒用lipofeetamine^TM 2000转染包装细胞PA317，获得DLXSN—PIGll逆转录病毒。用病毒感染HepG2细胞，获得PIGll高表达的HepG2细胞株。结果获得384bp人PIGll基因，测序证明PIGlleDNA编码序列与Genbank中报道的一致，转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞，经RT—PcR检测发现HepG2细胞中PIGllmRNA表达明显升高。结论成功构建了高表达PIGll基因的HepG2细胞株，为进一步研究其生物学行为奠定了基础。