白念珠菌细胞壁不溶性β-葡聚糖升高小鼠血清IL-1β、TNF-α的研究

为探讨白念珠菌β-葡聚糖升高白细胞的机制,通过培养白念珠菌来获取不溶性β-葡聚糖(Candida albicansinsoluble β-glucan,CAIBG),并以rhG-CSF作为阳性对照,计数实验组及对照组动物外周静脉血白细胞总数,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β、TNF-α,观测小鼠血清中IL-1β、TNF-α的变化,以及IL-1β、TNF-α与CAIBG诱导的末梢血白细胞计数之间的相关性。结果发现在实验组小鼠外周血白细胞,血清IL-1β、TNF-α较对照组均有明显升高(P<0.05)。结果表明白念珠菌不溶性β-葡聚糖可以通过升高小鼠血清IL-1β、TNF-α来刺激机体白细胞产生增加。     

颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达

目的：构建人颗粒溶素（Granulysin,GNLY）基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量（Mr）同预期值相一致。结论：成功构建了重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。     

颗粒溶素的克隆表达及活性分析

目的克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达。方法体外分离并培养外周血单个核细胞,抽提总RNA,RT-PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,并将其插入pMD18-T进行测序,鉴定正确后分别将目的基因亚克隆至pET32a(+),构建原核表达质粒pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blot鉴定融合蛋白的正确性。MTT检测颗粒溶素融合蛋白的生物活性。结果成功构建了原核表达载体pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量约31和37ku的融合蛋白,重组颗粒溶素融合蛋白能特异地与抗颗粒溶素抗体结合,GNLY9K融合蛋白可以明显抑制A549细胞增殖,而GNLY15K融合蛋白对细胞增殖影响极低。结论利用原核表达体系成功地表达了不同分子质量的颗粒溶素融合蛋白,为颗粒溶素的后续研究奠定了基础。     

热灭活白念珠菌通过Dectin-1诱导外周血单个核细胞表达IL-12和IFN-γ

为研究Dectin-1在热灭活白念珠菌刺激外周血单个核细胞(PBMC)免疫应答中的作用。我们用不同浓度昆布多糖(Dectin-1封闭剂)与PBMC共培养1 h后,再用热灭活白念珠菌刺激PBMC 4 d;同时用不同剂量的Dectin-1激活剂酵母聚糖(zymosan)刺激PBMC 4 d,收集培养液上清,经ELISA检测IL-12和IFN-γ水平。结果发现,昆布多糖可以部分抑制热灭活白念珠菌刺激PBMC合成IL-12和IFN-γ的能力,酵母聚糖可以诱导PBMC合成IL-12和IFN-γ。因此,Dectin-1是介导热灭活白念珠菌诱导PBMC产生IL-12和IFN-γ的受体之一。     

陶瓷磨损颗粒对体外培养外周血单核细胞分泌TNF-α的影响

目的探讨氧化铝陶瓷颗粒对人单核细胞分泌TNF-α各时间的影响。方法用氧化铝陶瓷颗粒(平均直径0．94微米)刺激人单核细胞,颗粒体积与细胞数为100:1,在颗粒刺激细胞2、6、12、16、24、 48h后,运用ELISA检测培养上清液中的TNF-α表达。结果氧化铝陶瓷颗粒可以刺激单核细胞产生更多的TNF-α,在12、16、24h三个时间点有统计意义(P<0．05)。结论氧化铝陶瓷磨损颗粒诱导的骨溶解是人工髋关节远期松动的原因之一,巨噬细胞受陶瓷颗粒刺激后合成和释放TNF-α,并呈现出时间相关性。     

重组人颗粒溶素的纯化及其单克隆抗体的制备

目的:纯化原核系统表达的颗粒溶素(GNLY),并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:用Ni亲和层析纯化重组人GNLY,用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。mAb纯化后,用间接ELISA法测mAb的效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸盐洗脱法测定mAb的相对亲和力指数,并进行Ig亚类、特异性及杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性检测。结果:经Ni亲和层析纯化的可溶性GN-LY融合蛋白,其纯度和含量分别为95%和0.8g/L。共筛选出能稳定分泌抗人GNLYmAb的杂交瘤细胞4株,分别为6C8、9C6、5G7和5E5。4株杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价分别为1∶100～1∶3200和(0.1～8)×10-4,5E5mAb的Ig亚类为IgM,其余3株mAb均为IgG1。结论:成功地纯化人GNLY融合蛋白。以其为免疫原制备的鼠抗人GN-LYmAb,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

TNF-α和IFN-γ对肾小管上皮细胞趋化因子表达的影响

目的探讨细胞因子TNF-α和IFN-γ对肾小管上皮细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11表达的影响。方法分别以TNF-α以及IFN-γ和TNF-α联合作用肾小管上皮细胞HK-2不同时间后,用Real-time PCR和ELISA分别检测CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA和蛋白水平。用流式细胞术检测淋巴细胞表面CXCR3表达情况,通过趋化实验检测细胞培养上清对淋巴细胞的趋化作用。结果肾小管上皮细胞在TNF-α作用12 h后能够诱导趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11mRNA表达上调,CXCL9 mRNA的表达在48 h达到高峰,而CXCL10和CXCL11 mRNA表达高峰在12 h;CXCL9、CXCL10和CXCL11蛋白的基础分泌水平均较低,在TNF-α作用12 h后,分泌水平也逐渐升高,CXCL9、CXCL10在48 h时分泌达到高峰,CXCL11分泌高峰在72 h。与TNF-α单独作用组和IFN-γ单独作用组相比,TNF-α和IFN-γ联合作用使肾小管上皮细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA表达和蛋白分泌明显增强(P<0.05)。与新鲜分离的淋巴细胞相比,活化的淋巴细胞表面的CXCR3表达明显升高(P<0.05)。TNF-α以及IFN-γ和TNF-α联合作用HK-2细胞培养上清对活化的淋巴细胞具有明显的趋化作用(P<0.05)且能被抗CXCR3抗体所阻断(P<0.05)。结论细胞因子TNF-α能诱导肾小管上皮细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11表达,且与IFN-γ联合作用对趋化因子的表达具有协同作用。     

Tyrosol和Farnesol对白念珠菌生物被膜形成作用初探

目的 研究密度感应分子(quorum sensing molecule)tyrosol(对羟基苯乙醇)和farnesol(法呢醇)对白念珠菌生物被膜形成的调控作用.方法 在tyrosol和farnesol干预下构建白念珠菌临床株和标准株生物被膜,在倒置显微镜下观察细胞形态,应用RT-PCR技术检测密度感应分子对白念珠菌HTA1和EFG1基因表达的调控作用,并采用MTT法观察密度感应分子对细胞活性的影响.结果 tyrosol对白念珠菌生物被膜的菌丝发生和细胞活性无明显促进作用,也无法中和farnesol对菌丝发生和细胞活性的抑制作用.tyrosol使白念珠菌生物被膜内细胞HTA1的表达增强,对EFG1的表达并无明显影响;tyrosol不能改变famesol对HTA1和EFG1表达的抑制作用.结论 tyrosol能在一定程度恢复口腔白念珠菌生物被膜内细胞的活跃状态,但当tyrosol与famesol同时存在时,tyrosol的作用被后者的抑制效应所掩盖,细胞对farnesol更敏感.     

LPS刺激对TACE基因表达和对TNF-α前体加工的影响

目的 :研究LPS刺激对肿瘤坏死因子转换酶 (TACE)基因转录和表达的影响及其与TNF α前体加工的关系。方法 :采用Dot blotting、Dot ELISA、间接免疫荧光和FACS等方法分别检测HL 6 0细胞在LPS刺激的不同时间段TACE、TNF α基因转录表达和膜分子分布情况。结果 :①HL 6 0细胞构成性高表达有活性TACE ,主要分布于细胞膜和核周边。②LPS刺激TNF α基因转录表达 ,但由于TACE的作用 ,膜TNF α(TM TNF α)下降 ,而分泌型TNF(sTNF α)增加 ;TACE的反义寡核苷酸 (ODN)显著抑制TNF α这种前体转换作用。③LPS同样刺激TACE基因表达增加 ,而且TACE酶解作用增强 ,但其蛋白表达和膜分子分布反而下降 ,推测TACE在发挥其催化膜蛋白作用后 ,其分子结构形式发生改变。结论 :炎症时分泌型TNF α增加不仅是该细胞因子基因表达增高所致 ,更受到TACE基因表达水平和活性状态的约束。     

NF-κB抑制剂PDTC抑制UHMWPE磨损颗粒诱导界膜组织产生TNF-α的实验研究

目的 探讨NF-κB抑制剂PDTC对高分子量聚乙烯磨损颗粒(UHMWPE)诱导的假体周围界膜组织产生TNF-α的影响,寻找防治假体周围骨溶解的方法.方法 用昆明小鼠24只构建air-pouch模型,随机分成两组,每组8只,阳性对照组(囊内注入UHMWPE颗粒悬液,腹腔注射生理盐水);实验组(囊内注入UHMWPE颗粒悬液,腹腔注射PDTC),阴性对照组(囊内注入生理盐水,腹腔注射PDTC),7天后处死动物,ELISA法检测囊壁组织中TNF-α的含量.结果 阳性对照组囊壁组织TNF-α含量为6.342910.7475(OD/克);实验组囊壁组织中TNF-α含量为5.0428±0.8105;阴性对照组囊壁中TNF-α含量为3.5010±0.7248.其中阳性对照组与实验组、阳性对照组与阴性对照组、实验组与阴性对照组之间两两对比均有显著统计学差异(P＜0.01).结论 NF-κB抑制剂PDTC能够抑制UHMWPE颗粒诱导的界膜组织中TNF-α的产生,对假体周围骨溶解有防治作用.     

抗白念珠菌天然抗体的检测与分析

目的检测正常机体内是否存在抗白念珠菌天然抗体。方法取饲养于无菌条件下的C57BL/6小鼠和SCID小鼠外周血,ELISA和流式细胞术检测血清中抗白念珠菌IgM和IgG抗体的水平。结果ELISA结果显示,与SCID小鼠相比,C57BL/6小鼠血清中存在一定滴度的抗白念珠菌IgM,但没有抗白念珠菌IgG;经白念珠菌预先吸附后,正常血清IgM与白念珠菌的结合明显减弱。流式细胞术分析显示,C57BL/6小鼠血清与白念珠菌的反应明显增强。结论正常机体内天然存在与白念珠菌结合的以IgM型为主的天然抗体。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和LPS的刺激效果研究

目的研究肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激的反应效果,探讨急性肺损伤体外细胞模型最佳造模方法。方法体外培养的A549细胞分为正常对照组(normal control,NC组),10 ng/ml TNF-α刺激2 h组,10 ng/ml和100 ng/ml LPS分别刺激2、4、8、16 h组。Western blotting检测胞浆IκB-α含量和IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平,qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA转录水平,ELISA检测细胞培养上清IL-1β和IL-6质量浓度。结果 TNF-α刺激导致A549细胞大量凋亡或死亡,而LPS刺激对A549细胞生长形态无明显影响,且与LPS的刺激质量浓度和时间无关。TNF-α刺激可明显增加A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平(P<0.05),而LPS刺激对A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平无明显影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。TNF-α刺激可显著增加A549细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA转录水平和培养上清中IL-1β、IL-6质量浓度(P<0.05),而LPS刺激对上述炎症因子的合成和分泌并无显著影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。结论 TNF-α可以有效刺激A549产生过度炎症反应,而LPS不能刺激A549细胞产生炎症损伤,因此建立急性肺损伤体外细胞模型时可以考虑用TNF-α代替LPS刺激。     

老年类风湿性关节炎患者血清ECE-1、ET-1、TNF-α和PBMC中PgP表达增强

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以对称性、多关节、小关节为主的慢性全身性自身免疫性疾病,其主要病理变化为巨噬细胞和T淋巴细胞等慢性炎症细胞浸润及大量多种细胞因子的分泌,最终促使关节骨质破坏、滑膜组织渐进性损伤[1-2].内皮素转换酶(endothelin-converting enzyme1,ECE-1)、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)以及TNF-α、P-糖蛋白(P-glycoprotein,PgP)与RA的发生、发展有重要关系.本研究通过ELISA检测了老年类风湿性关节炎患者血清中ECE-1、ET-1、TNF-α、Pgp水平,初步探讨老年类风湿性关节炎血清ECE-1、ET-1、TNF-α、PgP表达变化及其临床意义.     

急性丙型病毒性肝炎患者颗粒溶素在外周血中表达增高

目的 研究急性丙型病毒性肝炎患者外周血颗粒溶素（granulysin, GNLY）的表达水平及其临床意义。方法 收集30例急性丙型病毒性肝炎患者和30例体检健康者的全血和血清,分别行反转录聚合酶链反应（RT-PCR）测外周血单核淋巴细胞（PBMC）中GNLYmRNA的表达水平,酶联免疫吸附法（ELISA）法测血清中GNLY蛋白含量,并检测丙肝患者AST、ALT水平。结果 急性丙型病毒性肝炎患者组PBMC中GNLYmRNA表达水平（7.71±1.44）高于体检健康者（0.83±0.17）（P<0.01）;血清GNLY平均浓度(20.16 ± 6.03 ) ng/mL也高于体检健康者(9.94 ± 2.99)ng/mL (P<0.01)。PBMC中GNLYmRNA表达水平与血清HCV RNA表达水平呈负相关（r=﹣0.869,P<0.01）;血清GNLY含量与肝功能指标ALT呈正相关（r=0.522,P<0.01）,与AST呈正相关（r=0.661,P<0.01）。结论 急性丙型病毒性肝炎患者PBMC中GNLYmRNA表达和血清中GNLY蛋白含量显著高于健康人群,其表达水平的变化有助于了解患者机体细胞免疫状态,监测病情。     

IL-15对人外周血NK细胞内TNF-α表达的促进作用

目的:探讨IL-15对人外周血NK细胞胞内TNF-α表达的调节作用。方法:以密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,在加入IL-15(培养3d)条件下,以双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,检测TNF-α在NK细胞胞内表达水平的变化。结果:流式细胞术分析显示,在静止CD56 NK细胞的胞内TNF-α表达率为65.0%;加入终浓度为100000U/L的IL-15,培养3d后,NK细胞胞内TNF-α表达率为85.9%。结论:IL-15可明显促进人外周血NK细胞胞内TNF-α水平。     

TNF-α和IFN-γ刺激的人脐静脉内皮细胞上IgG受体的表达

目的:检测IgG受体(FcγR)在炎症细胞因子刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的表达。方法:采用ELISA、免疫组化染色法、免疫荧光法和RT-PCR等方法,检测FcγRII及其表达。结果:未经细胞因子刺激的正常HU-VEC可表达低水平的FcγRIIa;经2×105U/L TNF-α和1×105U/L IFN-γ联合刺激3d后,FcγRIIa的表达提高16倍(P<0.01)。免疫荧光法检测显示,TNF-α和IFN-γ诱导的FcγRIIa表达于HUVEC表面。RT-PCR结果显示,FcγRIIamRNA表达量在TNF-α和IFN-γ刺激24h后有明显提高。结论:TNF-α和IFN-γ可通过调节FcγRIIa的转录和翻译,增强其在HUVEC上的表达。FcγRIIa的表达可能与血管炎条件下,免疫复合物在血管上的特异性定位有关。     

阿利吉仑对慢性坐骨神经缩窄性损伤大鼠TNF-α表达的影响

目的探讨阿利吉仑对慢性坐骨神经缩窄性损伤(CCI)大鼠模型热痛阈和机械痛阈表达和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法通过在坐骨神经上结扎四个松结制备实验CCI大鼠模型,大鼠随机分为正常组、CCI组和阿利吉仑组(50 mg/kg,腹腔注射)。造模后14 d检测各组热痛阈和机械痛阈,实时荧光定量PCR检测坐骨神经TNF-αmRNA表达。结果与正常组比较,模型组和阿利吉仑组热痛阈和机械痛阈显著降低,TNF-αmRNA表达水平显著增高(0.01)。与模型组比较,阿利吉仑组坐骨神经热痛阈、机械痛阈显著增高,TNF-αmRNA表达水平显著降低(0.01)。结论阿利吉仑上调坐骨神经缩窄性损伤大鼠坐骨神经热痛阈和机械痛阈可能与下调TNF-αmRNA表达相关。     

乳杆菌对TNF-α诱导Caco-2细胞分泌IL-6和IL-8的影响

目的 研究嗜酸乳杆菌对TNF-α诱导Caco-2细胞表达细胞因子IL-6和IL-8的影响.方法 将嗜酸乳杆菌L050103-12与Caeo-2细胞共孵育,加入TNF-α-起温育2 h,收集细胞培养上清,ELISA检测IL-6和IL-8的水平;提取细胞总RNA,采用RT-PCR的方法检测IL-6和IL-8 mRNA的表达.结果 加入TNF-α(10 ng/ml)温育2 h后,与对照组相比,Caco-2细胞IL-6和IL-8的mRNA表达显著增强.IL-6和IL-8的分泌水平也显著增高(P＜0.01).提前给予嗜酸乳杆菌1950103-12与Caco-2细胞共孵育,与TNF-α处理组相比,TNF-α诱导Caco-2细胞IL-6和IL-8 mRNA表达相对减弱(P＜0.05),IL-6和IL-8的分泌水平也显著降低(P＜0.01).单独给予嗜酸乳杆菌1950103-12处理Caco-2细胞,其IL-6和IL-8 mRNA表达以及分泌与对照组相比,均无变化.结论 嗜酸乳杆菌1950103-12可以抑制TNF-α诱导Caco-2细胞表达促炎性细胞因子IL-6和IL-8.     

抗TNF-α治疗的最新研究进展

肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactor alpha, TNF α)是一种促炎性细胞因子, 在免疫反应、炎症和对损伤反应中起重要作用, 主要影响细胞增殖和细胞凋亡的调节, 不仅对肿瘤细胞有细胞毒 /细胞溶解、抑制增殖、诱导细胞凋亡等作用,还影响多种正常细胞的生长分化, 并与其他细胞因子一起形成复杂的免疫网络。TNF α主要是由单核 巨噬细胞分泌, 其他类型的细胞如淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等在一定条件下也具有产生和释放TNF α的能力。近年来用抗TNF α治疗Crohn’s病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、糖尿病、多…