荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立

目的:建立特异、灵敏的荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法.方法:首先用煮沸法提取血清中的HBVDNA,然后用绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)消化松弛环状HBV DNA(rcDNA),保留共价闭合环状DNA(cccDNA).设计一条嵌合引物,该引物分为两部分序列,近5'部分为人为设定的序列,近3'部分是与正链缺口下游互补序列.先用该嵌合引物以正链为模板,自HBV cccDNA1590nt开始向上游延伸,然后以嵌合引物中人为设定的序列为下游引物、与负链互补的上游引物以及一条在两引物之间与正链互补的Taqman探针,扩增检测嵌合引物延伸的产物.由于带有缺口的HBV rcDNA无法被嵌合引物延伸,因此最终只能扩增检测到cccDNA.结果:用含有相应HBV DNA片端的PUC19质粒模拟HBV cccDNA,该检测方法的检测灵敏度为1×103拷贝/ml;以模拟松弛环状DNA(rcDNA)与模拟HBV cccDNA按不同比例混合,在rcDNA与cccDNA的比为1×109拷贝/ml:1×103拷贝/ml时,该方法仍可检测到模拟cccDNA;单独检测模拟rcDNA浓度为1 × 109拷贝/ml时,该方法检测未出现假阳性.结论:该检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法操作简单、灵敏、特异.适用于检测血清中HBV cccDNA.     

乙型肝炎病毒血清学标志与其DNA相互关系的对比分析

本文采用酶免疫测定法（ＥＩＡ）及聚合酶链反应（ＰＣＲ）同时对２６９例乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染可疑者进行ＨＢＶ血清学标志（ＨＢＶＭ）及ＨＢＶＤＮＡ的检测。结果表明；ＨＢｓＡｇ的不同组合状态及ＨＢＶ感染的临床类型对血清ＨＢＶＤＮＡ检出率有显著性影响，而ＨＢＶ诸抗体的不同组合对之影响不显著。并对ＨＢＶＭ的临床意义有了新的认识。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.

Abstract：

Objective To establish and optimize a sensitive and specific quantitative realtime polymerase chain reaction(PCR)method for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA(HBV cccDNA)in liver tissue. Methods Specific primers and probes were designed to detect HBV DNA(tDNA)and cccDNA. A series of plasmids(3.44 × 100-3.44 × 109 copies/μl)containing a full double-stranded copies of HBV genome(genotype C)were used to establish the standard curve of real-time PCR. Liver samples of 33 patients with HBV related hepatocellular carcinoma(HCC), 13 Chronic hepatitis B patients(CHB)and 10 non-HBV patients were collected to verify the sensitivity and specificity of the assay. A fraction of extracted DNA was digested with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase(PSAD)for HBV cccDNA detection and the remaining was used for tDNA and β-globin detection. The amount(copies/cell)of HBV cccDNA and tDNA were measured by a real-time PCR, using β-globin housekeeping gene as a quantitation standard. Results The standard curves of real-time PCR with a linear range of 3.44 × 100 to 3.44 × 109 copies/μl were established for detecting HBV cccDNA and tDNA, and both of the lowest detection limits of HBV cccDNA and tDNA were 3.44 × 100 copies/μl. The lowest quantitation levels of HBV cccDNA in liver tissues tested in 33 HBV related HCC patients and 13 CHB patients were 0.003 copies/cell and 0.031copies/cell, respectively. HBV cccDNA and tDNA in liver tissue of 10 non-HBV patient appeared to be negative. The true positive rate was increasing through the digestion of HBV DNA by PSAD, and the analytic specificity of cccDNA detection improved by 7.24 × 102 times. Liver tissues of 2 patients were retested 5 times in the PCR for detecting cccDNA and the coefficience of variations on cycle threshold (Ct)were between 0.224%-0.609%. Conclusion A highly sensitive and specific quantitative real time PCR method for the detection of HBV cccDNA in liver tissue was established and could be used for clinical and epidemiological studies.     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×10⁰-3.44×10⁹copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 10⁰-3.44×10⁹ copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×10⁰copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 10²倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.     

应用聚合酶链反应（PCR）检测乙型肝炎患者的HBV—DNA

应用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测１０３例乙型肝炎患者血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ，在不同类型的ＨＢＶ感染标志物（ＨＢＶＭ）的血清中结果有所不同：（１）在ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和抗ＨＢｃ阳性血清中，ＰＣＲ阳性率８６．１１％（３１／３６）；（２）在ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｅ和抗ＨＢｃ阳性血清中，ＰＣＲ阳性率５５．８８％（１９／３４）；（３）在抗ＨＢｅ和ＨＢｃ阳性血清     

药物清除HBV病毒共价闭合环状DNA的研究进展

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)病毒共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA,cccDNA)的存在是乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的关键.作为HBV前基因组RNA复制的原始模板[1],病毒在宿主细胞内复制中形成第一中间体,对乙肝病毒的循环复制以及感染状态的建立具有重要意义.笔者从cccDNA的角度,对HBV感染和清除过程以及cccDNA在CHB中的作用、抗病毒治疗现状以及药物清除cccDNA的相关研究进行综述,旨在帮助临床医师理性确定抗病毒治疗策略,预测病毒学应答以及判断停药时机等方面具有重要指导意义.     

DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因型

目的 制备检测HBV基因型的DNA芯片并进行杂交验证.方法 设计多条HBV分型寡核苷酸探针,固定于醛基基片的特定位置,制备成芯片,采用酶呈色技术(BCIP/NBT显色)检测杂交信号,进行杂交验证分析.结果 106例临床样本均测出基因型,其中B型37例,C型69例;对所有样本进行测序分析,结果与芯片杂交一致,杂交的灵敏度和重复性等指标均佳.结论 DNA芯片检测HBV基因型,操作简便易行,技术要求不高,适于临床推广应用.     

套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBcVccDNA

目的:建立套式聚合酶链反应法(nPCR)检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)。方法:根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列,设计两套相对保守的引物,建立HBV cccDNA套式PCR,并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA。结果:该法检测200例慢性乙型肝炎患者,HBV cccDNA阳性率为60%。结论:套式PCR法简便、灵敏,可用于测定PBMC中HBV cccDNA。     

中国11城市乙型肝炎病毒慢性感染者中乙型肝炎病毒基因型分布

目的了解中国乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者中HBV基因型的分布情况。方法收集北京、清远、深圳、石家庄、汉川、南京、长春、济南、聊城、宁波和温州市共1214份HBV DNA阳性的慢性HBV感染者血清样本,用型特异性引物聚合酶链反应法（PCR）进行基因型测定,并对其中部分样本以PCR产物直接测序验证。结果在1214份血清中,检测到A基因型9例,占0．7%;B基因型345例,占28．4%;C基因型709例,占58．4%;B、C混合基因型（B＋C）151例,占12．4%。未检测到其他基因型。北方地区（长春、北京、石家庄市等）慢性HBV感染者中,C基因型比例较高,分别为58．2%、67．5%和63．6%,山东省聊城和济南市的C基因型比例分别高达90．2%和87．9%。随地理位置南移,B基因型比例逐渐增加,广东省清远和深圳市的B基因型比例分别为71．4%和63．6%。结论HBV基因型分布有明显地区差异。在中国慢性HBV感染者中,HBV C和B基因型为主要流行株。北方地区以C基因型为优势株,而南方地区则B基因型较为多见。     

江苏地区乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

目前乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)基因型分型的方法有 :全基因或S基因序列测定、聚合酶链反应限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)、单克隆抗体酶联免疫吸附法、特异性线型探针法等。迄今为止 ,已发现A到H 8种HBV基因型。国内外众多学者研究表明 ,HBV基因型存在区域性分布特征 ,并与临床疾病谱、疾病的进展以及抗HBV治疗反应不同等方面可能相关[1] 。本研究采用HBVS区直接测序法对江苏地区 12 8例不同类型HBV感染者进行基因分型 ,并分析基因型与临床疾病谱之间的关系。1　材料与方法1.1　研究对象　 12 8例HBV感染者来自…     

等位基因PCR检测HBV X基因变异及其临床应用

目的 建立等位基因特异PCR检测乙型肝炎病毒X基因变异的方法,为临床应用提供基础.方法 在3'端设计和合成与野生和突变碱基互补的引物,建立等位基因PCR检测碱基变异的方法,检测慢性乙型肝炎(CHB)和HBV相关肝细胞癌(HCC)患者血清样本中HBV X基因变异,并与核苷酸序列测定方法对比.结果 HCC组的HBVX基因变异率均显著高于CHB组(P＜0.05).该PCR检测方法与核苷酸序列测定方法对比,经统计学检验,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HCC发生与HBV X基因变异密切相关.所建立的PCR检测HBV X等位基因变异方法,结果可靠,且简便易行,对HCC的诊断具有一定参考价值.     

稳定表达HBV C蛋白羧基端siRNA抑制HBV cccDNA的实验研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)C蛋白羧基端短小的干扰RNA(siRNA)对HBV超螺旋双链闭环DNA(cccDNA)水平的影响.方法设计合成1对能稳定表达针对HBV C基因羧基端(2389nt-2410nt)序列的22-mer siRNA寡核苷酸,其两端带有限制性酶切位点,表达后可形成发夹结构,退火后形成双链;然后将这一双链寡核苷酸与重组腺相关病毒载体(rAAV)连接,构建重组体rAAV-siRNA.将重组体rAAV-siRNA加入培养增殖良好的22.1.5细胞中孵育,72 h后用实时聚合酶链反应(Real timePCR)法检测经处理过的22.1.5细胞和培养上清中HBV cccDNA的表达水平和HBV DNA的复制水平.结果重组体rAAV-siRNA实验组HBV cccDNA水平较空白对照组显著降低(P＜0.01),HBVDNA的复制水平在实验组亦明显下降;在无关序列对照组未发现对HBV cccDNA水平影响和HBV DNA复制的抑制作用.结论HBV羧基端siRNA能显著降低HBV cccDNA的水平和HBVDNA的复制.     

PCR荧光法对乙型肝炎病毒基因分型的检测及临床意义

目的 用荧光聚合酶链反应(PCR)技术,对乙型肝炎(HBV)患者基因型进行检测,了解该地区HBV基因型分布及其与肝功能损害、病毒复制水平的关系.方法 采用荧光聚合酶链反应(PCR),检测乙型肝炎病毒基因型,通过荧光探针识别基因型特异性序列,采集分析荧光信号确定病毒基因型,并分别检测谷丙转氨酶(ALT)水平、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和HBV-DNA含量.结果 532例慢性HBV感染者中,HBV基因型以C型为.主占60.2％,其次为B型占31.6％,B、C混合型占6.0％,未分型占2.3％例;C基因型HBV-DNA水平和HBeAg阳性率分别为(6.41±1.15)lg拷贝/ml和91.3％,明显高于B型(5.88±1.30)lg拷贝/ml和83.3％,差异有统计学意义(P＜0.01);C基因型患者的ALT(130.16±197.19)U/L高于B基因型(125.6±145.02)U/L,但差异无统计学意义.结论 甘肃地区HBV基因型以C型为主,B型次之,C基因型HBV-DNA水平显著高于B基因型,C基因型HBeAg阳性率较B基因型高,C基因型对肝脏损害较B基因型重,并与HBV载量及HBeAg系统具有相关性.     

外周血HBV_cccDNA检测在乙型肝炎患者抗病毒治疗中的应用

目的:研究外周血cccDNA在乙肝患者抗病毒治疗中的作用。方法:在34例乙型肝炎患者抗病毒治疗前、6个月和12个月采集外周血,分别检测血浆ALT、AST、cccDNA、HBV-DNA和单个核细胞的cccD-NA,进行统计学分析。结果:ALT、AST水平在抗病毒治疗前与治疗6个月、12个月均有差别(P<0.01),但治疗12个月与6个月无差别(P分别为0.36、0.28);血浆cccDNA与HBV-DNA治疗前、治疗6个月与12个月三组间均有差别(P<0.01);按治疗前血浆cccDNA阴、阳性分组,治疗6个月后HBV-DNA转阴率有差别(P=0.048<0.05),治疗12个月后HBV-DNA转阴率无差别(P=0.667)。结论:外周血血浆cccD-NA检测对抗病毒治疗有一定预测意义。外周血单个核细胞cccDNA的检测对于肝移植患者乙肝的复发提供了理论依据。     

多重PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA

目的建立多重聚合酶链反应法(Multiplex Polymerase chain reaction，M—PCR)，揭示慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)中HBVDNA的存在状况。方法采用一种把一套扩增乙肝病毒基因组DNA(HBV genome DNA)的引物和一套特异性扩增乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBVcccDNA)的引物掺入到一个体系中的PCR法，检测PBMC中的HBVDNA核酸分子。结果PCR法可使处于同一PBMC中的总HBVDNA和HBVcccDNA同时分别良好的扩增出来；30例慢性乙肝患者的PBMC中，总HBVDNA与HBVcccDNA同耐检出者23例，检出率76．6％；检出HBVcccDNA者占检出总HBVDNA者的82．1％。结论PBMC中的HBVDNA部分参与复制。成功的建立了能同时检测HBV基因组DNA与HBVcccDNA的M—PCR方法。     

HBV—DNA定量与HBV血清学标志物的相关性探讨

目的探讨HBV—DNA定量与HBV血清学标志物（HBV—M）的相关性。方法采用实时荧光定量PCR（FQ—PCR）检测449例乙肝感染者血清的HBV—DNA含量,并用酶联免疫吸附试验（ELISA）对其血清学标志物进行检测。结果在不同HBV—M模式中,HBV—DNA与preS1总检出率无显著差异。在模式HBsAg（＋）、HBeAg（＋）和HBcAb（＋）中血清HB—DNA含量明显高于其他模式。在278例HBV—DNA阳性的标本中,HBV—DNA与preS1检出率无显著差异（P〉0．05）,HBV—DNA与HBeAg检出率有显著差异（P〈0．01）,同时preS1阳性组HBV～DNA定量值显著高于preS1阴性组。结论HBV—DNA或preS1与HBV复制密切相关,preS1较HBeAg更能敏感反映HBV在体内的复制状况,联合检测HBV—DNA与HBV血清学标志物,在乙型肝炎的诊断治疗中更有重要的临床指导价值。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测唾液HBV-DNA含量

目的:采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法准确地定量检测血清、唾液中乙型肝炎病毒(HBV)的数量和免疫指标,进而全面评估唾液乙肝DNA在乙型肝炎的预防、诊断及治疗方面的意义。方法:采用FQ-PCR法检测200例乙型肝炎患者血清、唾液中HBVDNA的含量。结果:(1)经FQ-PCR检测,200份标本中血清HBVDNA含量>103copies/ml的有180例(90%),相应的唾液中HBVDNA含量>103copies/ml的有145例(72.5%),同时病毒含量>105copies/ml标本中血清168例(84.0%),唾液98例(49.0%),血清HBVDNA与唾液HBVDNA水平之间存在显著相关(r=0.79,P<0.001)。(2)在不同的血清免疫指标组合中乙肝病毒含量也不相同,在HBeAg( )组与HBeAg(-)组中,血清与唾液的病毒含量与阳性率均存在HBeAg( )组明显高于HBeAg(-)组,在HBeAg( )组中血清、唾液HBVDNA平均水平分别为7.13、5.01 logcopies/ml。血清、唾液病毒含量在两组不同免疫组合中差别均有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)乙型肝炎患者除了血清外,唾液中也存在具有感染性的高病毒载量HBVDNA,可能成为传染源之一。(2)唾液中定量检测HBVDNA与血液中HBVDNA含量存在明显相关性,在一定程度上也能反映HBVDNA在体内复制情况。     

儿童乙型肝炎病毒携带者HBV基因型分析

目的检测温州地区儿童乙型肝炎病毒携带者HBV基因型和Ba／Bj亚型的分布，及其与病毒复制水平的关系。方法采用实时荧光PCR技术进行HBV基因分型和HBVDNA定量，对鉴定为B基因型标本，采用PCR-RFLP结合PCR产物直接序列测定其基因亚型（Ba／Bj）。结果温州地区儿童乙型肝炎病毒携带者HBV基因型B、C、B＋C混合型和D型分别占43．92％、53．44％、1．59％和1．06％；C基因型的HBVDNA含量与B基因型之间差异无统计学意义（P2〉0．05）；83例B基因型HBV均为Ba亚型，未发现Bj亚型。结论温州地区儿童乙型肝炎病毒携带者HBV基因型主要为c基因型和B基因型，B基因型HBV主要为Ba亚型。