参麦注射液致RBL-2H3细胞脱颗粒的研究

目的 探讨参麦注射液(SMI)对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响及其原因。方法 以C48/80为工具药建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型, 检测不同浓度C48/80与RBL-2H3细胞作用不同时间后细胞β-己糖苷酶、类胰蛋白酶和组胺的释放率以及细胞活力, 在细胞活力大于80%情况下, 选择释放程度较高的指标和条件为优选考察指标和条件。将SMI和其溶剂(Tween-80)原液等比稀释成不同浓度后与RBL-2H3细胞共同培养, 通过中性红染色法观察细胞脱颗粒的形态学变化, 分别用显色法和间接荧光法检测细胞上清的β-己糖苷酶和组胺释放率, 采用细胞计数法(CCK-8)检测细胞的活力。结果 RBL-2H3细胞脱颗粒模型的最佳作用时间为30 min, 最佳指标为β-己糖苷酶和组胺释放率。与空白组相比, SMI质量浓度低于13.3 g生药/L(3倍临床浓度)时, 细胞中性红染色未见脱颗粒现象, 组胺和β-己糖苷酶释放率亦无差异;而在Tween-80质量浓度为1.00 g/L时, SMI 40 g生药/L(9倍临床浓度)组和溶剂1.00 g/L组细胞中性红染色均可见脱颗粒现象, 细胞上清组胺和β-己糖苷酶释放率亦明显增加。此外, CCK-8结果显示, 与空白组相比, 各浓度的SMI对细胞活力均无影响。结论 SMI低于3倍临床浓度无明显RBL-2H3细胞脱颗粒作用;而在9倍临床浓度能刺激细胞脱颗粒, 这种脱颗粒作用可能与所含溶剂(Tween-80)有关, 与其对RBL-2H3的细胞毒性作用无关。提示SMI在低于3倍临床浓度相对安全, 在9倍临床浓度时有致类过敏反应的风险。     

聚山梨酯80对多源肥大细胞脱颗粒的影响研究

目的 通过比较不同浓度聚山梨酯80溶液对RBL-2H3、P815、Ku812细胞脱颗粒的影响,探究聚山梨酯80的量与过敏反应的关系,进而筛选出一套灵敏、稳定的体外肥大细胞脱颗粒模型。方法 体外培养RBL-2H3、P815和Ku812细胞,测定3株细胞的生长曲线,在细胞生长对数期,以不同浓度（0.04、0.20、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 mg/mL）聚山梨酯80分别刺激3株细胞,采用中性红染色法显微镜下观察不同浓度聚山梨酯80溶液对3株细胞脱颗粒的影响,并计算脱颗粒百分率,同时以化学发光法分别检测组胺和β-氨基己糖苷酶释放率,以酶联免疫吸附法测定类胰蛋白酶的释放量;并进一步检测聚山梨酯80对人的肥大细胞IgE释放的影响。结果 3株肥大细胞脱颗粒模型中,各细胞的脱颗粒指标均随聚山梨酯80浓度的升高而升高。相同浓度聚山梨酯80对人源、大鼠、小鼠肥大细胞的类胰蛋白酶释放量无较大统计学差异;与RBL-2H3细胞系比较,P815细胞和组胺释放率显著降低（P<0.05、0.01）,Ku812细胞组胺释放率和β-氨基己糖苷酶释放率显著升高（P<0.05、0.01）,Ku812细胞脱颗粒最灵敏。但在实验过程中发现Ku812细胞模型稳定性、可重复性较差,而RBL-2H3细胞稳定性、可重复性均优于Ku812和P815细胞。0.04~80.00 mg/mL的聚山梨酯80溶液作用于Ku812细胞产生的IgE均低于检测限。结论 聚山梨酯80诱导的过敏反应可能是不经过IgE介导的类过敏反应,随着聚山梨酯80浓度的增大,3个细胞模型脱颗粒现象显著,相比于Ku812和P815细胞,RBL-2H3细胞更适合作为体外肥大细胞脱颗粒检测模型。     

基于RBL-2H3与P815细胞体外模型的聚山梨酯80、维生素K1注射剂、注射用两性霉素B脂质体类过敏反应潜在风险评价

目的 基于 RBL-2H3及 P815细胞系,选择 Compound 48/80（C48/80）为阳性药构建类过敏反应的体外评价模型,初步评价聚山梨酯80、维生素K₁注射剂（VK₁I）、注射用两性霉素B脂质体（ABL）导致类过敏反应的潜在风险。方法 应用 CCK-8 法检测 C48/80（10、30、60、100 μg·mL^-1）、聚山梨酯 80（2.5、5.0、10.0、50.0 mg·mL^-1）、VK₁I（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg·mL^-1）、ABL（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg·mL^-1）对 RBL-2H3、P815 细胞活性的影响,计算半数抑制浓度（IC₅₀）,阳性药及受试物均选择＜IC₅₀浓度进行后续实验;结合中性红染色形态学观察,研究阳性药及受试物的细胞毒性;流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞率及Fluo-4AM标记率;ELISA法检测β-氨基己糖苷酶（β-Hex）及组胺释放量。结果 中性红染色结果显示,在C48/80作用下RBL-2H3、P815细胞部分皱缩或者偶有破损,但大部分细胞仍维持完整细胞形态;在聚山梨酯 80、ABL、VK₁I高浓度的作用下,RBL-2H3、P815细胞大部分仍能保持正常形态。C48/80在＜IC₅₀浓度时能够引起较强的细胞脱颗粒反应,模型建立成功。聚山梨酯80、VK₁I在＜IC₅₀浓度时均出现了浓度相关性细胞脱颗粒现象,与对照组比较,2种细胞聚山梨酯80 2.5、5.0 mg·mL^-1组及VK₁I 0.75、1.50、3.00 mg·mL^-1组Annexin V阳性率、Fluo-4AM标记率均显著升高（P＜0.05、0.01）;聚山梨酯 80 2.5、5.0 mg · mL^-1 组及 VK₁I 1.5、3.0 mg·mL^-1组的组胺、β-Hex释放量显著升高（P＜0.05、0.01）。ABL 组 Annexin V 阳性率浓度相关性升高趋势不明显 ,与对照组比较 ,仅 P815 细胞 ABL 2.00 mg·mL^-1组显著升高（P＜0.05）,且升高幅度不大 ;与对照组比较 ,2种细胞ABL 1、2 mg·mL^-1组的Fluo-4AM标记率和组胺、β-Hex释放量显著升高（P＜0.05、0.01）。结论 聚山梨酯80、VK₁I高浓度具有导致类过敏反应产生风险,ABL 还需进一步研究。     

RBL-2H3细胞脱颗粒模型评价注射用丹参多酚酸的安全性

目的 通过RBL-2H3肥大细胞脱颗粒模型考察注射用丹参多酚酸及丹参多酚酸B、D的致敏性。方法 RBL-2H3肥大细胞分为对照（PBS）组、C48/80 （阳性对照,4 mg/mL）组和梯度浓度（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800 mg/mL）的注射用丹参多酚酸、丹参多酚酸B、丹参多酚酸D组,孵育30 min后,通过中性红染色试验观察脱颗粒现象,化学荧光法测定组胺释放率,酶联免疫吸附（ELISA）法测定β-氨基己糖苷酶释放率、类胰蛋白酶释放量。结果 与对照组比较,阳性药C48/80组、质量浓度≥0.2 mg/mL的丹参多酚酸B组、质量浓度≥0.4 mg/mL的丹参多酚酸D组、质量浓度为0.8 mg/mL的注射用丹参多酚酸组的细胞脱颗粒度显著升高（P<0.01、0.05）;注射用丹参多酚酸没有引起RBL-2H3细胞组胺释放率增加,C48/80组、质量浓度≥0.025 mg/mL的丹参多酚酸D组、0.8 mg/mL的丹参多酚酸B组组胺释放率即显著升高（P<0.001、0.05）;注射用丹参多酚酸和丹参多酚酸B组类胰蛋白酶释放量无显著性差异,质量浓度≥0.025 mg/mL的丹参多酚酸D组类胰蛋白酶释放量显著增加（P<0.001）;注射用丹参多酚酸没有引起β-氨基己糖苷酶释放率增加,0.8 mg/mL的丹参多酚酸D组、质量浓度≥0.1 mg/mL的丹参多酚酸B组的β-氨基己糖苷酶释放率显著增加（P<0.001）。结论 注射用丹参多酚酸在致敏性方面有较好的安全性。     

基于RBL-2H3细胞和ICR小鼠过敏与类过敏叠加模型评价注射用血塞通(冻干)过敏与类过敏反应

目的 建立过敏和类过敏叠加的RBL-2H3细胞和ICR小鼠动物模型,对注射用血塞通(冻干)(XST)的过敏与类过敏反应进行评价研究。方法 体外以RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶(β-Hex)和组胺释放率为评价指标,确定抗二硝基苯单克隆抗体(DNP-IgE)、DNP-牛血清白蛋白(BSA)的剂量及与C48/80(30 μg·mL^-1)作用的最佳时间,筛选过敏和类过敏叠加模型的阳性条件,随后考察XST (4、8、16 mg·mL^-1)对细胞活力及与DNP-IgE/BSA叠加后对细胞脱颗粒的影响。体内以ICR小鼠为实验对象,以(类)过敏反应症状分值及血浆中免疫球蛋白E (IgE)、组胺、5-羟色胺、血管内皮生长因子A (VEGF-A)、末端补体复合物(SC5b-9)含量为评价指标,筛选卵蛋白(OVA,2.5、5.0、10.0 mg·kg^-1)、C48/80(1、2、4 mg·kg^-1)过敏-类过敏模型阳性条件,最后对XST (60、120、240 mg·kg^-1)的致敏性及是否会产生过敏、类过敏反应进行评价。结果 体外细胞实验最终确定400 ng·mL^-1的DNP-IgE致敏后用50 ng·mL^-1的DNP-BSA激发的同时与C48/80共同作用30 min作为过敏与类过敏叠加阳性组;16 mg·mL^-1的XST与DNP-IgE/BSA联合叠加时,与单给DNP-IgE/BSA或XST组比较均促进组胺和β-Hex的释放(P<0.01)。体内小鼠实验中5、10 mg·kg^-1的OVA均会使小鼠体内IgE显著升高,依据过敏样反应分值和小鼠血浆内组胺、VEGF-A和SC5b-9含量最终确定5 mg·kg^-1 OVA与1 mg·kg^-1 C48/80建立叠加模型,耳、肺及支气管组织中可见明显的水肿及炎性细胞浸润。单纯的XST不会对小鼠致敏,但是与OVA介导的过敏反应叠加后,与单给DNP-IgE/BSA或XST组比较,会显著提高血浆中内组胺、VEGF-A和SC5b-9水平(P<0.05、0.01),与建立的过敏-类过敏叠加模型表现出较好地一致性。结论 体外体内实验均表明IgE介导的过敏反应和C48/80引起的类过敏反应会产生叠加作用,加剧过敏介质的释放和免疫反应程度。同时此模型的建立也验证了XST存在过敏与类过敏叠加现象,该模型可为中药注射剂的临床前安全性评价及合理用药提供参考。     

基于实时细胞分析技术评价注射用益气复脉(冻干)类过敏反应

目的 建立中药注射剂体外类过敏反应评价方法,快速评价不同批次注射用益气复脉（冻干）类过敏反应表现。方法 体外培养嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞,选择Compound 48/80为阳性药,采用实时细胞分析（real-time cell analysis,RTCA）系统检测药物干预后引起的细胞指数（CI）值变化,并利用甲苯胺蓝、鬼笔环肽染色观察细胞形态、骨架变化,以及检测组胺和β-已糖苷酶释放量验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。选择20个批次的注射用益气复脉（冻干,100 μg/mL）作用于RBL-2H3细胞,进行基于RTCA技术的类过敏反应评价。结果 阳性药Compound 48/80（20 μg/mL）能够使RBL-2H3细胞的CI值在加药后30 min内呈先快速上升后下降趋势;形态学研究发现,Compound 48/80使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象;组胺和β-己糖苷酶释放实验进一步证实Compound 48/80导致炎症介质的释放,引起了明显的脱颗粒现象;提示RTCA系统可以用于快速敏感的评价RBL-2H3细胞脱颗粒。不同批次的注射用益气复脉（冻干）对RBL-2H3细胞CI值无明显影响,提示所选批次为合格批次,无类过敏反应现象的发生。结论 建立了一套基于RTCA系统的类过敏反应体外快速评价技术,可用于注射用益气复脉（冻干）等中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。     

羌活醇及异欧前胡素对脂多糖诱导大鼠成纤维样滑膜细胞增殖抑制的影响

目的 探讨羌活醇及异欧前胡素对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖抑制的影响。方法 复制经脂多糖(LPS)诱导的大鼠成纤维样滑膜细胞(CIA-FLS)模型,分别给予不同浓度的羌活醇(25、50、100、200、400 μg·mL^-1)、异欧前胡素(25、50、100、200、400 μg·mL^-1)及阳性药泼尼松龙（400 μg·mL^-1）,另设空白对照组,观察给药前后成纤维样滑膜细胞形态差异;采用噻唑蓝(MTT)法测定不同给药时间、不同给药浓度下成纤维样滑膜细胞的抑制率,计算半数抑制浓度（IC₅₀）;硝酸还原酶法测定羌活醇和异欧前胡素对大鼠成纤维化滑膜细胞中一氧化氮（NO）水平的影响;ELISA测定肿瘤坏死因子a (TNF-a)表达的影响。结果 造模细胞较正常细胞增殖力强,细胞粗大,纤维样,呈层叠状生长;羌活醇组给药后细胞增殖力减弱,生长良好;异欧前胡素给药后细胞增殖力锐减,生长状况不佳。给药12 h,羌活醇未测出半数抑制浓度值,异欧前胡素半数抑制浓度值为160 μg·mL^-1;给药36 h,羌活醇、异欧前胡素半数抑制浓度值分别为190、120 μg·mL^-1;给药60 h,分别为80、45 μg·mL^-1,异欧前胡素的增殖抑制能力强于羌活醇（P＜0.01）。给药羌活醇与异欧前胡素对一氧化氮总体含量和细胞因子肿瘤坏死因子a含量均有显著性降低（P＜0.01）,且异欧前胡素的降低更显著。结论 羌活醇及异欧前胡素对大鼠成纤维样滑膜细胞均有增殖抑制作用(P＜0.05),均使一氧化氮含量和细胞因子TNF-a的含量显著减少（P＜0.01）,二者都有很好的增殖抑制能力,且异欧前胡素的抑制效果优于羌活醇。     

天麻多糖对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用

摘 要 目的:研究天麻多糖（polysaccharides from gastrodia elata blume,GEP）对皮质酮(corticosterone, CORT)诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法: 采用水提醇沉法提取,经Sevag法脱蛋白及透析处理制得GEP。将培养好的细胞分为正常对照组、模型组（200 μmol·L^-1 CORT）和GEP高（1 000 μg·ml^-1）、中（500 μg·ml^-1）、低（250 μg·ml^-1）剂量组。GEP与CORT共孵PC12细胞48 h后,采用MTT比色法判断细胞损伤的程度;化学比色法测定乳酸脱氢酶的释放量;倒置显微镜和DAPI荧光染色法观察PC12细胞凋亡形态。结果:与正常对照组相比,模型组细胞存活率显著降低(P<0.01),LDH释放量增加,且凋亡细胞增多。当给予GEP后,各剂量组均能显著降低LDH释放量,细胞存活率增加,凋亡细胞显著减少(P<0.01)。结论:GEP对皮质酮诱导PC12细胞损伤具有一定的保护作用,为GEP的临床应用提供试验依据。     

UHPLC-ESI-QE-Orbitrap-MS结合TRIF/p-IκBα/NF-κB/NLRP3信号通路的蛤蚧定喘丸抗炎机制与活性成分探讨

目的 探讨蛤蚧定喘丸的抗炎机制,推测蛤蚧定喘丸发挥抗炎功效的关键活性成分。方法 依次采用石油醚、无水乙醇、超纯水对蛤蚧定喘丸不同极性的化学成分进行提取;利用2、4、8、16、32、64、128 μg·mL^-1的醚提物、醇提物、水提物处理RAW264.7细胞,分别通过CellTiter-Lumi（CTL）发光法和钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein/PI）染色法检测细胞活力,确定提取物的安全浓度;利用各提取物处理脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞炎症模型,通过格里斯试剂（Griess）测定一氧化氮（NO）释放量,通过酶联免疫吸附（ELISA）法检测白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌,筛选具有抗炎活性的提取物。利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术（UHPLC-ESI-QE-OrbitrapMS）对有抗炎活性的提取物进行物质分析,推测抗炎活性物质及作用机制,并利用蛋白免疫印迹法（Western blotting）进一步验证其对硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）/p-核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）/核因子-κB（NF-κB）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）信号通路相关蛋白表达的影响。结果 醚提物、醇提物、水提物在质量浓度低于64 μg·mL^-1时均未影响细胞活力。与模型组相比,醇提物在质量浓度大于8 μg·mL^-1时显著降低NO释放量（P<0.05）,醚提物和醇提物在质量浓度高达64 μg·mL^-1时仍未产生抗炎效果;醇提物显著降低了TNF-α、IL-1β的释放量（P<0.05）。醇提物中共分析出36种主要化学成分。经Western blotting实验验证,与模型组比较,蛤蚧定喘丸醇提物对RAW264.7细胞炎症模型内NLRP3炎症小体、β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、p-IκBα的表达均有显著降低作用（P<0.05）,而对TXNIP、Toll样受体4（TLR4）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路蛋白的影响并不显著。结论 蛤蚧定喘丸通过抑制TRIF/p-IκBα/NF-κB/NLRP3信号通路以及iNOS、MCP-1的合成发挥抗炎功效,推测巴马汀、麻黄碱、伪麻黄碱、小檗碱、甘草素、药根碱、小檗红碱为其抗炎活性成分。     

丹参水溶性成分拮抗脂多糖诱导HTR8/SVneo滋养层细胞凋亡的作用机制

目的 探讨丹参水溶性成分拮抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导HTR8/SVneo细胞凋亡的相关作用机制。方法 以不同浓度(0,100,200,400,800,1 600 ng·mL^-1)LPS处理HTR8/SVneo细胞,采用实时定量聚合酶链式反应验证HTR 8/SVneo细胞炎症模型的建立;细胞活力检测试剂盒检测各组细胞活力;划痕试验评估各组细胞向损伤区域迁移能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率并分析各组细胞线粒体膜电位。结果 200 ng·mL^-1 LPS干预后HTR8/SVneo细胞的NLRP3炎症小体指标及炎症因子表达量增高(P<0.05)。与LPS组相比,丹酚酸B(0.08 μmol·L^-1)、丹酚酸C(0.4 μmol·L^-1)、紫草酸(0.08 μmol·L^-1)干预后HTR8/SVneo细胞活性明显升高(P<0.01)。与LPS组比较,丹参水溶物质组凋亡率显著降低(P<0.05或P<0.01),线粒体膜电位水平显著升高。结论 丹参水溶物质能够提高LPS干预后HTR8/SVneo细胞活力,改善细胞迁移能力,提高细胞线粒体膜电位,进而抑制细胞凋亡。