肺热普清散对MHV-A59感染小鼠治疗作用及炎症因子的影响

目的 探讨藏药经典方肺热普清散对小鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）感染小鼠模型的影响及其对炎症因子的作用。方法 以雄性昆明种小鼠为实验对象,利用 MHV-A59 滴鼻操作建立小鼠冠状病毒感染模型,设置对照组、模型组、阳性（利巴韦林）组和肺热普清散低、中、高剂量（25、50、100 mg·kg^-1）3组,每天ig给药1次,连续给药10 d,考察记录造模期内小鼠体质量变化,处死后称体质量并计算小鼠肺脏指数和肝脏指数;使用Elisa试剂盒测定小鼠血清中炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）含量;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测小鼠肝脏中IL-1β、IL-18 的mRNA表达水平和血清中MHV-A59病毒载量;通过苏木素-伊红（HE）染色,检测肺热普清散对肝脏和肺脏细胞坏死及炎症细胞浸润的影响。结果 与对照组比较,模型组的体质量增长缓慢（P＜0.01）;肺热普清散 3 个剂量组的体质量每日递增,中、高剂量组在第5～8天均与模型组有显著差异（P＜0.01）;各组小鼠肺脏指数组间无显著性差异,肺热普清散中剂量组肝脏指数与模型组有显著性差异（P＜0.05）;模型组病毒感染后血清中炎症因子 IL-1β 和 IL-18 显著性升高（P＜0.001）,与模型组比较,肺热普清散 3个剂量组均可降低血清中 IL-18水平（P＜0.001、0.01）;模型组肝脏组织中 IL-1β和IL-18 的 mRNA 表达水平均显著升高 （P＜0.001）;与模型组比较,肺热普清散高剂量组肝脏中 IL-1β转录水平显著降低（P＜0.01）;与模型组比较,肺热普清散 3组实验动物肝脏组织中 IL-18水平未出现显著性变化;MHV载量测定结果显示,与模型组比较,利巴韦林组和肺热普清散高剂量组血清中MHV载量显著性降低（P＜0.01）;病理切片结果显示,模型组肝脏细胞出现广泛坏死和变性,并出现炎症细胞浸润,气球样变等现象,肺热普清散高剂量和利巴韦林组出现点状病灶、炎症细胞浸润等明显减少现象;模型组肺组织肺泡明显间隔增厚,间质水肿,肺泡被压缩,有炎症细胞浸润,毛细血管扩张充血等现象,而肺热普清散中、高剂量组和阳性组肺组织肺泡间隔较窄,肺泡舒展,局部有炎性浸润和出血,肺泡腔内的分泌物明显减少。结论 肺热普清散对MHV-A59感染小鼠模型具有保护作用,其作用机制与抑制病毒复制和抑制感染后炎症因子有关。     

番茄红素通过ROS/NF-κB调控乳腺癌干细胞干性和化疗敏感性的研究

目的 探讨番茄红素对乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)干性和化疗敏感性的影响及其可能的作用机制。方法 体外培养乳腺癌MCF-7细胞,通过悬浮培养和流式细胞术筛选CD44⁺MCF-7干细胞(BCSC)进行后续实验;BCSC分为对照组和番茄红素组(5 μmol·L^-1),给药24 h后,球体形成试验检测BCSC球体形成大小和数量;对照组和番茄红素组BCSC经不同浓度顺铂(0,5,10,20,40,80 μmol·L^-1)处理24 h,CCK8试验检测BCSC细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况;流式细胞术检测对照组和番茄红素组BCSC中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;BCSC经10 μmol·L^-1活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)或10 μmol·L^-1 NF-κB抑制剂BAY 11-7085(BAY)处理24 h后,Western blotting检测细胞中p NF-κB和干性相关蛋白LSD1及SOX9的表达水平。结果 CD44⁺细胞中LSD1和SOX9蛋白表达水平显著高于CD44^-细胞;番茄红素明显降低BCSC球体形成数量和大小;番茄红素显著提高顺铂诱导的BCSC细胞凋亡率;番茄红素显著降低BCSC中ROS水平;番茄红素与NAC均降低细胞中p NF-κB蛋白表达水平;番茄红素、NAC和BAY均抑制细胞中LSD1、SOX9蛋白表达水平,且分别经番茄红素、NAC和BAY处理后,BCSC对顺铂敏感性明显升高。结论 番茄红素可能通过ROS/NF-κB信号通路抑制乳腺癌干细胞干性,增强顺铂治疗的敏感性。     

丹参水溶性成分拮抗脂多糖诱导HTR8/SVneo滋养层细胞凋亡的作用机制

目的 探讨丹参水溶性成分拮抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导HTR8/SVneo细胞凋亡的相关作用机制。方法 以不同浓度(0,100,200,400,800,1 600 ng·mL^-1)LPS处理HTR8/SVneo细胞,采用实时定量聚合酶链式反应验证HTR 8/SVneo细胞炎症模型的建立;细胞活力检测试剂盒检测各组细胞活力;划痕试验评估各组细胞向损伤区域迁移能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率并分析各组细胞线粒体膜电位。结果 200 ng·mL^-1 LPS干预后HTR8/SVneo细胞的NLRP3炎症小体指标及炎症因子表达量增高(P<0.05)。与LPS组相比,丹酚酸B(0.08 μmol·L^-1)、丹酚酸C(0.4 μmol·L^-1)、紫草酸(0.08 μmol·L^-1)干预后HTR8/SVneo细胞活性明显升高(P<0.01)。与LPS组比较,丹参水溶物质组凋亡率显著降低(P<0.05或P<0.01),线粒体膜电位水平显著升高。结论 丹参水溶物质能够提高LPS干预后HTR8/SVneo细胞活力,改善细胞迁移能力,提高细胞线粒体膜电位,进而抑制细胞凋亡。     

丁苯酞对糖氧剥夺条件下人脑微血管内皮细胞炎症反应的调节作用

目的 研究丁苯酞调节糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）条件下人脑微血管内皮细胞（human brainmicrovascular endothelial cells,HBMEC）炎症反应的机制。方法 采用OGD方法处理HBMEC,将细胞分为对照组、模型组和丁苯酞低、中、高剂量组。其中对照组为正常培养的HBMEC,模型组为OGD处理的细胞,低剂量组为OGD+5 μmol·L^-1的丁苯酞,中剂量组为OGD+10 μmol·L^-1的丁苯酞,高剂量组为OGD+20 μmol·L^-1的丁苯酞。采用流式细胞术检测细胞凋亡水平,CCK-8法检测细胞活力的变化,Western-Blot法检测细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB （p-P65）、caspase-1和procaspase-1的表达水平,免疫酶联法检测上清中白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）,白细胞介素6（IL-6）的分泌水平。实时荧光定量PCR检测HMGB1、TLR4、NF-κB（P65）、caspase-1、IL-1β的mRNA表达。结果 OGD处理可以诱导HBMEC活力下调和HBMEC细胞凋亡,且具有时间依赖性,相比对照组具有显著性差异（P<0.05）;而丁苯酞干预后,HBMEC细胞活力比模型组显著上调（P<0.05）,细胞凋亡率比模型组显著下降（P<0.05）。OGD处理可以导致HBMEC中HMGB1-TLR4-NF-κB信号的激活,诱导炎症因子caspase-1、IL-1β的表达上调,相比对照组具有显著性差异（P<0.05）;而丁苯酞干预可以显著下调HMGB1-TLR4-NF-κB信号的表达,下调caspase-1、IL-1β的表达。结论 丁苯酞可能通过抑制HMGB1-TLR4-NF-κB信号的表达调节OGD下HBMEC细胞炎症反应。     

猪苓多糖在幽门螺杆菌相关胃炎中的保护作用及机制研究

目的 通过幽门螺杆菌(Hp)感染小鼠建立Hp相关胃炎模型,探讨猪苓多糖的保护作用及机制。方法 将C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、模型组、猪苓多糖(250 mg·kg^-1)组、核转录因子-κB (NF-κB)通路的抑制剂——吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC,阳性对照,100 mg·kg^-1)组。除对照组外,其余各组小鼠ig给予Hp悉尼株1(SS1)菌液(1×10⁹ CFU·mL^-1),第1天每只0.4 mL,以后连续3 d每天ig 1次,每次0.2 mL。ig Hp完成4周后,猪苓多糖组和PDTC组给予相应剂量的药物,对照组和模型组小鼠给予无菌水,每只0.4 mL,每天1次持续14 d。将胃取出,沿胃大弯切开,肉眼观察胃黏膜变化;吉姆萨染色验证Hp在小鼠胃黏膜的定植;HE染色观察小鼠胃黏膜组织的炎症浸润状态;免疫组化检测核因子-κB(NF-κB) p65的表达;Western blotting法检测小鼠胃腺组织炎症因子白细胞介素-8(IL-8)蛋白表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中IL-8的表达。结果 与模型组比较,猪苓多糖组小鼠胃黏膜褶皱整齐,出血点消失,黏膜光滑,胃黏膜颜色红润有光泽;炎症细胞浸润和其他组织损伤明显减少;细菌定植数量明显减少;胃上皮细胞中NF-κB p65的表达减弱;胃腺组织IL-8蛋白表达水平显著降低(P<0.001);小鼠血清中IL-8表达水平显著降低(P<0.001)。结论 猪苓多糖可能通过抑制炎症信号通路NF-κB相关分子的表达在Hp相关胃炎中发挥保护作用。     

基于斑马鱼模型的中药来源化合物血管抑制活性筛选

目的 利用斑马鱼高通量模型，对10种中药来源化合物进行筛选。方法 选取受精后转基因血管荧光Fli-1品系斑马鱼对10个中药来源的化合物进行筛选，用不同的药物浓度分别作用于斑马鱼，观察对斑马鱼体血管的影响。以斑马鱼肠下血管面积为主要指标，斑马鱼肠下血管出芽数为次要指标进行定量分析，考察各化合物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果 木犀草素(87.34 μmol·L^–1)、洋川芎内酯A(52.02 μmol·L^–1)、盐酸小檗碱(537.91 μmol·L^–1)、和厚朴酚(9.39 μmol·L^–1)、齐墩果酸(10.95 μmol·L^–1)组斑马鱼肠下血管面积与正常对照组相比肠下血管面积显著减少(P<0.01或P<0.001)；木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚对肠下血管面积的抑制作用分别为12%，17%，18%，15%，24%；各化合物与正常对照组相比斑马鱼肠下血管出芽数无显著性差异；阳性对照组(索拉非尼5 μmol·L^–1)斑马鱼肠下血管面积与正常对照组比较显著性减少(P<0.05)，其对血管新生的抑制作用为22%，肠下血管出芽数与正常对照组相比显著性减少(P<0.05)。结论 木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚具有抑制血管新生作用。     

基于网络药理学和实验验证探讨升降散治疗急性肺损伤作用及机制

目的 基于网络药理学和动物实验探究升降散治疗急性肺损伤（ALI）的作用机制。方法 在中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP）和Swiss Target Prediction数据库中检索升降散的成分及靶点,在基因数据库（Gene Cards）中检索ALI的疾病靶点。将药物与疾病交集靶点上传至STRING数据平台进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析,运用DAVID网站进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。体内实验,除对照组外,升降散各给药组分别ig给药20 mL·kg^-1药液（散剂、水煎液高、低剂量分别为175、350 mg·kg^-1）,每天早晚各1次,共连续给药14 d;地塞米松组第12天开始ip地塞米松（5 mg·kg^-1）,连续给药3 d;除对照组外,其余各组第15天分别向气管内滴注1 mg·mL^-1脂多糖（5 mg·kg^-1）进行造模,观察肺组织病理损伤情况,ELISA法检测白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平,实时荧光半定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测Toll样受体4 （TLR4）、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38 （p38-MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK-1） mRNA表达量,Western blotting法检测核因子κB（NF-κB）和人核因子κB抑制蛋白α（IκBα）表达量。结果 网络药理学预测出升降散活性成分32个,关键靶点292个,ALI疾病靶点有1 454个,两者交集靶点95个;升降散治疗ALI的关键靶点主要参与NF-κB、MAPK等信号通路。通过ALI小鼠模型实验结果显示,升降散能够显著减轻ALI小鼠肺部组织炎症,改善肺泡间隔及肺泡壁增厚程度;降低血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平（P＜0.05、0.01）;下调TLR4、p38-MAPK、ERK、JNK-1 mRNA的表达量（P＜0.05、0.01）;Western blotting结果表明升降散可通过抑制NF-κB蛋白磷酸化水平（P＜0.01）,激活IκBα蛋白（P＜0.01）,缓解ALI。结论 升降散能够基于多成分、多靶点、多通路的特点相互协同治疗ALI,其机制可能与NF-κB、MAPK等信号通路有关,且散剂治疗ALI的作用优于水煎液。     

基于NF-κB信号通路的高通量药物筛选细胞炎症模型的建立

目的 建立均相时间分辨荧光（homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF）测定炎症细胞模型中NF-κB的方法,为高通量筛选呼吸道炎症药物提供实验依据。方法 采用HTRF检测细胞中Total-NF-κB及Phospho-NF-κB比率来确定NF-κB磷酸化程度。观察不同细胞密度（每孔5,25,50,100,150 k）、不同刺激因子（TNF-α、LPS）、不同作用时间（10,30,60 min）等条件对支气管平滑肌细胞（BSMC）、支气管上皮细胞（HBE）NF-κB磷酸化的影响,建立炎症细胞模型及HTRF测定NF-κB的方法。结果 采用HBE细胞,细胞密度为每孔10 k,刺激因子TNF-α（10 ng·mL^-1）刺激细胞,刺激10 min建立炎症细胞模型,可使细胞中NF-κB磷酸化水平达到52.6%,与正常对照组（14.2%）相比,有明显升高。结论 成功建立了快速、特异性高、操作简便的HTRF测定细胞炎症模型中NF-κB磷酸化程度的方法,为气道炎症药物筛选研究提供了依据。     

基于斑马鱼模型的高良姜素安全性评价研究

目的 评价高良姜素（GA）对斑马鱼整体形态及心、肝、肾主要脏器的影响。方法 采用不同浓度（1、2、4、6、8、12、18、28、30、32、64 μmol·L^-1）高良姜素处理受精后48 h（48 hpf）的斑马鱼,给药24、48 h后（24、48 hpe）,计算斑马鱼死亡率和畸形率;显微镜下观察高良姜素对斑马鱼形态、心率、心包面积、静脉窦-动脉球（SV-BA）距离、肝脏、卵黄囊吸收及眼部水肿情况的影响。结果 斑马鱼暴露在1、2、4、6、8、12 μmol·L^-1浓度下的高良姜素均无死亡;24 hpe,高良姜素对斑马鱼的半数致死浓度（LC⁵⁰）为30 μmol·L^-1;48 hpe的LC⁵⁰为28 μmol·L^-1。与空白对照组比较,24 hpe ,浓度≥ 8 μmol·L^-1的高良姜素处理斑马鱼畸形率显著上升（P<0.05）;48 hpe,浓度≥6 μmol·L^-1的高良姜素处理斑马鱼畸形率显著升高（P<0.01）。与空白对照组相比,4 μmol·L^-1及以下浓度的高良姜素对斑马鱼形态及心、肝、肾无明显影响。与空白对照组相比,在24 hpe,8 μmol·L^-1高良姜素组斑马鱼发育评分、相对体长显著降低（P<0.001）,心脏出现轻微的心包水肿、心包面积显著增加（P<0.05）、心率及SV-BA距离无明显变化,肝脏面积和肝脏荧光强度显著减小（P< 0.001）,卵黄囊面积显著增加（P<0.001）,肾脏无明显变化;在48 hpe,6 μmol·L^-1浓度及以上高良姜素组发育评分显著降低（P<0.05、0.001）,斑马鱼心脏出现轻微的心包水肿、心包面积显著增加（P<0.001）、心率显著减小（P<0.01）、SV-BA距离显著增加（P< 0.01）,肝脏面积和肝脏荧光强度显著减小（P<0.01、0.001）,卵黄囊面积显著增加（P<0.01、0.001）,8 μmol·L^-1组相对体长显著降低（P<0.001）。结论 高良姜素在4 μmol·L^-1及以下对斑马鱼无毒性影响;6 μmol·L^-1及以上浓度对斑马鱼有轻微的心脏毒性和肝脏毒性,在临床应用中要合理控制用量。     

去水卫矛醇对斑马鱼神经发育毒性评价

目的 探讨去水卫矛醇(dianhydrogalactitol,DAG)诱导斑马鱼胚胎及幼鱼神经发育毒性作用及其机制。方法 在一般毒性评价的基础上,对斑马鱼胚胎进行相应的分组暴露给药,采用幼鱼的自主运动反应、光照刺激反应等试验观察DAG对斑马鱼神经及行为的影响;通过脑部组织病理学检查、吖啶橙染色,观察DAG对斑马鱼脑部的组织影响;利用实时荧光定量PCR方法测定斑马鱼幼鱼体内多巴胺神经元相关基因(DAT、TH、GCH1)及神经抑/促凋亡相关基因(Bax、Bcl-2)的相对表达量。结果 DAG在20,40,75 mg·mL^-1下能明显抑制斑马鱼的自主运动,且自主运动抑制率呈现明显的浓度相关性;DAG在20,40,75 mg·mL^-1下对斑马鱼反应速度有较明显的抑制作用,反应能力下降率呈现浓度相关性;DAG各浓度组斑马鱼脑组织形态变小,但组织结构均未见显著异常;采用吖啶橙染色检测斑马鱼整体胚胎细胞凋亡情况,发现给药组头部绿色荧光比对照组明显,说明细胞凋亡增多,且细胞凋亡呈剂量依赖性增加,与表观一致;DAG在75,150,300,425,600 mg·L^-1下可导致斑马鱼幼鱼多巴胺能神经元相关基因DAT、TH、GCH1的mRNA相对表达量下调,Bax/Bcl-2的RNA相对表达量随着给药浓度增加而上升。结论 高浓度DAG对斑马鱼胚胎和幼鱼具有神经发育毒性作用,可能与多巴胺能神经元的抑制作用有关。