血管内皮生长因子受体启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸对结直肠癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的CDglyTK融合基因（AdKDR-CDsbrTK）体系联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对结直肠癌细胞（sw620）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增产生重组腺病毒。体外感染表达KDR的SW620、ECV304细胞株,同时用survivin ASODN转染同一细胞株,观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况。应用RT．PCR和Western印迹检测CDglyTK和survivin基因的表达．MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果survivin ASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并且两者的转染及感染效率无明显变化。CDglyTK可在SW620、ECV304细胞株高效表达。survivin ASODN可明显降低survivin蛋白表达。各基因治疗组细胞存活率明显低于阴性对照组（P〈0．001）。survivinASODN与AdKDR—CDglyTK基因联用后。随着前药浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异具有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5-FC 2000μg／ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK,两者间差异无统计学意义（P〉0．05）。Survivin ASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用,在前药浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的AdKDR-cDglyTK体系和survivin ASODN基因联合,较单一基因具有更强的特异性杀伤结直肠癌细胞及血管内皮细胞的作用。     

f血管内皮生长因子受体介导的双自杀基因重组腺病毒联合Survivin反义寡核苷酸对血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动的CDglyTK融合基因体系联合Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对血管内皮细胞的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的ECV304细胞株,同时用Survivin ASODN转染同一细胞株,应用逆转录-聚合链反应(RT-PCR)和Western blot检测CDg- lyTK和Survivin基因的表达,观察两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果Sur- vivin ASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并对两者的转染及感染效率无明显影响,CDglyTK可在ECV304细胞株高效表达,Survivin ASODN可明显降低Survivin蛋白表达。单独导入IC50的Survivin ASODN基因,细胞存活率为(55．90±3．61)％,与AdKDR-CDglyTK基因联用后,在GCV 60 mg／L、5-FC 500 mg／L时,细胞存活率明显低于单用AdKDR-CDglyTK或Survivin ASODN(P< 0．05),但在GCV 100mg／L、5-FC 2 000mg／L时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR- CDglyTK,两者间差异无统计学意义(P>0．05)。联合基因较单一基因对ECV304细胞具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的CDglyTK融合基因体系和Survivin ASODN基因联合,较单一基因具有更强的特异性杀伤血管内皮细胞的作用。     

KDR启动子驱动的双自杀基因对实体瘤细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因(AdKDRCDglyTK)体系对实体肿瘤细胞及血管内皮细胞靶向杀伤作用。方法分别将KDR和CMV启动子融合基因腺病毒体外感染表达KDR的ECV304、MCF7、MGC803及SW620细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5FC和/或GCV,观察其对各细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果两种腺病毒对各细胞的感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,各细胞株均达约100%感染;感染AdCMVCDglyTK的各组细胞和感染AdKDRCDglyTK的ECV304、MCF7、MGC803及SW620对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无统计学意义(P均>0.05);与其他细胞相比,感染AdKDRCDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01);且观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤实体肿瘤细胞及血管内皮细胞。     

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对肝癌细胞的靶向杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统（AdKDR- CDglyTK）对肝癌细胞选择性杀伤作用。方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后，体外感染表达KDR的BEL-7402细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株，并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果 所得病毒滴度为2.5×10^12pfu/ml。两种细胞的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的递增而增加。RT-PCR方法 检测发现：感染AdKDR-CDglyTK的BEL-7402有目的 基因CDglyTK的表达，感染AdKDR- CDglyTK的LS174T细胞无目的 基因表达。表达KDR的BEL-7402细胞对前药具有较高的敏感性，不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感（F=750.03，P〈0.001）。融合基因的疗效优于任一单自杀基因（F=275.89，P〈0.05）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的肝癌细胞。     

AdKDR-CDglyTK系统对结直肠癌细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的研究腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子受体(KDR)启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对血管内皮细胞及结直肠癌肿瘤细胞的选择性杀伤作用。方法质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK和pAdEasy-CMV-CDglyTK在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的ECV304、SW620细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-氟胞嘧啶(5-FC)及更昔洛韦(GCV)处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果两种病毒滴度均为2.0×1012pfu/ml。两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR方法检测发现:除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR-CDglyTK的其他两种细胞均有目的基因CDglyTK的表达。该体系治疗结果提示:(1)感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR-CDglyTK的ECV304、SW620细胞对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无显著性意义(均P>0.05),与前两者相比感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(均P<0.001);(2)双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(均P<0.001);(3)该体系旁观者效应明显。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的血管     

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的　探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系,对人脐血管内皮细胞ECV30 4的选择性杀伤作用。方法　将质粒pAdEasy -KDR- CDglyTK在2 93细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的ECV30 4细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5 - 氟胞嘧啶(5 -fuorocytosine ,5 -FC)和/或丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV) ,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果　所得病毒对两种细胞细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加;表达KDR的ECV30 4细胞对前药的具有较高的敏感性,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P均<0 . 0 1) ;融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0 . 0 1) ;且观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测治疗后ECV30 4细胞G1期比率增多及S期细胞减少(P均<0 . 0 1) ,同时,电镜下可见ECV30 4有凋亡和坏死改变。结论　KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞。     

腺病毒介导HSV-TK／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌实验研究

目的观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷（HSV-TK／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方珐利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率;利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV／TK以及Ad-CMV-HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受转染细胞的存活率。结杲重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0.01）,MOI为1时转染率为8.3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad-CMV-HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERTp-HsV／TK只杀伤LNcaP（P〈0.001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0.01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol／L时存活率为95.4％,MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6.1％,并有旁观者效应。结论重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV-TK／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染和CD/5-FC对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用重组腺病毒介导外源CD基因转移到人直肠癌细胞株HR-8348,通过检测腺病毒的转导效率,CD基因表达,以及集落形成实验,细胞存活率测定,裸鼠移植癌治疗实验,观察分析CD/5-FC对癌细胞的杀伤作用,结果 重组腺病毒介导CD基因转染,在癌细胞中得到高效表达。CD/5-FC系统对转染含CD重组腺病毒HR-8348细胞的集落形成,细胞生长均有明显的抑制作用,而对无CD基因转染癌细胞无影响,在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,CD/5-FC除了杀伤转染CD基因的癌细胞外,对周围的无CD转染癌细胞也有明显的杀伤作用。表现出很强的“旁观者效应”。裸鼠皮下移植癌治疗实验结果表明,CD/5-FC对HR-8348实体癌生长抑制率为71.5%。结论 CD/5-FC对腺病毒介导CD基因转染的直肠癌细胞有很强的杀伤作用和显著的“旁观者效应”。     

腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞，用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF-7，G418筛选出阳性细胞MCF-7／CD tk，然后加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Fc)或／和丙氧鸟苷(GCV)，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的MCF-7／CD tk和MCF-7细胞混合，联合应用5-Fc和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5-Fc或GCV均能对MCF一7／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用．其旁观者效应明显。     

AdKDR-CDglyTK融合基因系统治疗胰腺癌的实验研究

目的 观察腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因系统(以下简称为AdKDR-CDglyTK)对胰腺癌的治疗作用.方法 采用培养细胞移植法,将人胰腺癌细胞系Capan-2接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人胰腺癌移植瘤模型.将20只裸鼠随机分为4组,每组5只.分组方法:Ⅰ组:注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK与前药5-FC与GCV;Ⅱ组:仅注射前药5-FC与GCV;Ⅲ组:仅注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTKⅣ组:空白对照,不施加任何处理.重组腺病毒AdKDR-CDglyTK采用瘤体内多点注射,5-FC与GCV给药方法采用腹腔内注射的方法,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理等指标;应用透射电镜观察细胞超微结构,用TUNEL法检测细胞凋亡率,比较观察各治疗组的治疗效果;并对各组的肿瘤组织行RTPCR的检测,以了解有无双自杀基因CDglyTK的表达.结果 第Ⅰ组裸鼠移植瘤的生长显著受到抑制,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长情况无明显差别.第Ⅰ组肿瘤细胞凋亡指数为(34.20±4.60)%,较对照组显著增加(P=0.00).结论 AdKDR-CDglyTK联合前药5-FC及GCV对人胰腺癌Capan-2细胞具明显的抑制作用,并且诱导裸鼠体内人胰腺癌Capan-2细胞的凋亡.其可能的机制是通过下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达.     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染人PA317细胞，用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC-SD，G418筛选出阳性细胞(GBC-SD/CD tk，应用不同浓度的5-FC或(和)GCV，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的GBC-SD/CD tk和GBC-SD细胞混合，联合应用5FC和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5FC或GCV均能对转染阳性的GBC-SD／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的　研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法　将GBC SD/CD tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果　单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论　双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。     

血管内皮生长因子受体启动子双自杀基因治疗乳腺癌

目的 探讨腺病毒介导的KDRP-CD/TK融合基因对乳腺癌裸鼠体内抑瘤作用的特点.方法 以MCF-7细胞株建立裸小鼠乳腺癌动物模型,随机分为Ⅰ组[注射重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)与丙氧鸟苷(GCV)]、Ⅱ组(仅注射前药5-FC与GCV)、Ⅲ组(仅注射重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK)及Ⅳ组(空白对照,不施加任何处理).治疗结束后,计算抑瘤率、常规病理检查、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测瘤体CD/TK融合基因的表达以及微血管密度(MVD)变化的检测,同时观察该治疗体系有无系统毒性.结果 各组瘤重如下:Ⅰ组(实验组)(25.04±3.09)mg、Ⅱ组(498.07±4.47)mg、Ⅲ组(501.94±4.50)mg、Ⅳ组(503.79±6.27)mg.可见Ⅰ组肿瘤逐渐缩小,余各组肿瘤逐渐增大(F=12 727.420,P＜0.01);第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长差异无统计学意义(P＞0.05);Ⅰ组有CD/TK基因表达且MVD(1.05±0.04)较对照组(4.15±0.10)变小(t=64.126,P＜0.01);常规病理检查发现Ⅰ组组织片状坏死,且该治疗体系对重要脏器无毒性作用.结论 KDR启动子驱动双自杀基因体系对裸鼠皮下移植瘤有明显的生长抑制作用,其机制涉及对肿瘤及其血管内皮细胞的双重杀伤.     

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合基因体外抑瘤效果的观察

目的：构建重组腺病毒载体，观察自杀基因对不同大肠癌细胞系的细胞毒作用。方法：利用重组腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、HCT－8和直肠腺癌细胞系HR－8348，通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法），检测和分析HSV－tk／丙氧鸟苷（GCV）、CD／5－氟胞嘧啶（5－FC）双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小。结果：Western Blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自然基因可以在3种肿瘤细胞中表达。不加5－FC和GCV时，各转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：94、93、95；96、94，比较差异无显著性（P＞0．05）。在5－FC（80．0mg/L）和GCV（0．8mg/L)浓度下3种肿瘤细胞存活率降至2．1％、4．3％和3．2％，与不同前药相比差异有显著性（P＜0．01）。感染细胞在混合细胞中比例仅仅占5％时，就能获得明显的旁观者效应，细胞杀伤率分别升至22．2％、34．8％和40．4％。结论：CD、TK融合基因联合联合双前药治疗能取得显著的抗肿瘤作用。