雷藤舒(LLDT-8)对成纤维样滑膜细胞分泌趋化因子的影响

研究(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(雷藤舒,LLDT-8)对TNF-α联合IL-17诱导类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)分泌趋化因子GRO-α、ENA-78、MCP-1、MIP-1α和RANTES的影响。ELISA法检测FLS上清液中GRO-α、ENA-78、MCP-1、MIP-1α和RANTES的浓度;RT-PCR法检测FLS中GRO-α、ENA-78、MCP-1、MIP-1α和RANTES mRNA的表达。结果显示LLDT-8可显著抑制TNF-α联合IL-17诱导的FLS上清液中GRO-α、ENA-78、MCP-1、MIP-1α和RANTES的表达;也可有效抑制TNF-α联合IL-17诱导的FLS GRO-α、ENA-78、MCP-1、MIP-1α和RANTES mRNA的表达。该研究提示LLDT-8通过抑制FLS产生GRO-α、ENA-78、MCP-1、MIP-1α和RANTES而在RA的治疗中发挥抗炎作用。     

Fractalkine对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响

目的明确fractalkine(CX3CL1)对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)增殖的影响。方法通过组织块法培养RA-FLS。分别用0、50、100ng/mL重组人fractalkine刺激RA-FLS24h,用四唑盐(MTT)法检测其吸光度值,比较各组间增殖率。结果 50ng/ml及100ng/ml fractalkine均可促进RA-FLS增殖(P=0.005,P=0.022)。结论 Fractalkine可促进RA-FLS的增殖,可部分解释RA-FLS自主增殖的特性。     

RICTOR对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活力的影响

 目的：通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）mTORC2的特异组成蛋白RICTOR的表达,观察其对细胞活力的影响。方法：组织块法培养RA-FLS。应用阳离子脂质体转染的方法,把化学合成的特异性RICTOR siRNA转染RA-FLS,并以转染非特异性siRNA作为阴性对照。利用荧光定量PCR法分析转染24 h后细胞RICTOR mRNA表达水平的变化;Western blotting法分析转染48和72 h后细胞RICTOR蛋白表达水平的变化;以噻唑蓝（MTT）比色法检测转染成纤维样滑膜细胞不同时间（24、48和72 h）RICTOR siRNA对细胞活力的影响。结果：荧光定量PCR结果显示特异性RICTOR siRNA转染组与对照组相比,细胞中RICTOR的mRNA表达水平显著下调,24 h干扰效率达78.3%±63.71%（P<0.01）。Western blotting结果显示与对照组相比,RICTOR siRNA转染组48 h和72 h后RICTOR蛋白表达水平明显降低,沉默效率分别为92.48%±6.14%和98.57%±1.40%（均P<0.01）。MTT结果显示,早期（24和48 h）RICTOR siRNA转染组与阴性对照组细胞存活率比较无显著差异;72 h后,RICTOR siRNA转染组与阴性对照相比,细胞活力明显降低,抑制率为90.14%±1.90%（P<0.01）。结论：转染特异性RICTOR siRNA可降低RA-FLS的活力,提示mTORC2可能与RA-FLS的生长有关。     

周期性机械拉伸对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响

目的探讨周期性机械拉伸对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)增殖能力的影响。方法实验组细胞在周期性机械拉伸频率为1.0 Hz、拉伸幅度为3%、6%和9%的条件下,分别对RA-FLSs加载2、6和12 h。对照组细胞在保持与实验组培养条件一致的情况下不进行拉伸刺激。机械拉伸后,用流式细胞术和MTS检测细胞的增殖和活性。RT-PCR检测加载后细胞周期调控因子(CyclinD1、CyclinE1、CDK2、P27)在基因水平上的表达变化。结果 6%和9%的拉伸刺激持续作用6、12 h使RA-FLSs增殖和活性显著降低(P<0.05),同时CDK2和CyclinE1的mRNA表达降低,P27 mRNA的表达增高(P<0.05),周期性机械拉伸对CyclinD1表达的影响相对较小。结论周期性机械拉伸对RA-FLSs增殖能力的影响与拉伸强度以及持续的时间有关,6%和9%的机械拉伸刺激可以抑制RA-FLSs的增殖,而这种增殖抑制作用可能是通过调控CyclinE1,CDK2和P27的表达来实现的。本研究对于探讨力学刺激在类风湿性关节炎的发病机制以及临床防治中的作用具有一定意义。     

趋化因子CCL5/RANTES在类风湿关节炎患者滑液及滑膜中的表达

类风湿关节炎 (ＲＡ)是一种常见的慢性关节炎 ,其主要病理改变之一为大量炎性细胞在滑膜的浸润和在滑液的渗出。近期的研究显示 ,ＲＡ的这一病理改变与趋化因子 (ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ)在病变关节产生增多有关。有报道表明ＣＣ亚族趋化因子受体 5 (ＣＣＲ5 )在ＲＡ关节浸润的炎性细胞中表达增高 ,提示ＲＡ病变关节内ＣＣＲ5的配体可能产生增多。为探讨这种可能性 ,我们对ＣＣＲ5配体ＣＣＬ5(ＲＡＮＴＥＳ)在ＲＡ关节组织中的表达进行了研究符合美国风湿病学会 1987年的ＲＡ诊断标准的ＲＡ患者 2 8例 ,男 5例 ,女 2 3例 ,平均年龄 38岁 ,平均病…     

TL1A促进类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞分泌PGE_2

为了探讨肿瘤坏死因子样配体1A(TL1A)对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)分泌前列腺素E2(PGE2)的影响,分离培养6例RA FLS,并分别用TL1A、肿瘤坏死因子受体(TNFR)拮抗剂(0.25μg/ml)加TL1A(50ng/ml)以及信号通路抑制剂(10μmol/L)加TL1A(50ng/ml)刺激。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测RA FLS Cox-2mRNA的表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA FLS培养上清液中PGE2的水平。统计学方法采用t检验。结果显示,与未刺激组相比,TL1A刺激的RA FLS Cox-2mRNA和PGE2表达均增多(P0.05);加入TNFR2拮抗剂可使TL1A刺激的RA FLS分泌PGE2水平显著降低(P0.05)。此外,细胞培养体系加入NF-κB和JNK抑制剂后,TL1A刺激RA FLS产生PGE2水平明显下降(P0.05)。研究表明,TL1A与TNFR2结合可能通过NF-κB和JNK信号通路促进RA FLS分泌PGE2,参与RA的发病过程。     

白细胞介素-34 对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞CCL28 表达的影响

目的:初步探讨白细胞介素-34(IL-34)对类风湿关节炎(RA)患者成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)CC 趋化因子配体28(CCL28)表达的影响。方法:选取6 例RA 患者关节滑膜分离并培养FLS,分别用IL-34、IL-34 受体拮抗剂/ IL-34、信号通路抑制剂/ IL-34 刺激。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测FLS CCL28 mRNA 的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中CCL28 水平。两组间比较采用t 检验。结果:与对照组相比,IL-34 刺激后FLS 分泌CCL28 增多(P<0.05);加入IL-34 受体拮抗剂后FLS 分泌CCL28 水平降低(P<0.05);细胞培养体系中加入核因子-κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶38(p38MAPK)信号通路抑制剂后,CCL28 表达明显降低(P<0.05)。结论:IL-34 与其受体结合可能通过激活NF-κB 和p38 MAPK 信号通路促进RA FLS 分泌CCL28,从而参与RA 的发病过程。     

S100A4在类风湿关节炎滑膜中的表达及其对成纤维样滑膜细胞分泌VEGF促进血管生成的影响

目的:研究S100钙结合蛋白A4(S100A4)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者和正常人膝关节滑膜中的表达水平,以及S100A4对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs)促进血管生成的影响。方法:滑膜分别取自RA患者(RA组)及正常人(control组)膝关节,免疫组化法观察S100A4和VEGF蛋白在2组滑膜中的表达情况。RAFLSs分离自活动性RA滑膜;ELISA法检测S100A4刺激RAFLSs分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用;用rh S100A4孵育RAFLSs的条件培养基作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),检测S100A4体外血管生成能力。结果:S100A4及VEGF蛋白在RA组滑膜中高表达(P0.05),rh S100A4显著刺激RAFLSs分泌VEGF,呈时间和剂量依赖性(P0.05);rh S100A4孵育RAFLSs的条件培养基可促进HUVECs在体外形成管腔。结论:S100A4蛋白在RA患者膝关节滑膜中高表达,S100A4可通过促进RAFLSs分泌VEGF来刺激滑膜血管生成。这些结果提示S100A4可作为治疗RA的潜在靶点。     

STF-31对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡影响的机制分析

目的 观察STF?31对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RAFLs)的增殖以及凋亡的作用并分析其机制。方法 应用2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L浓度的STF?31处理RAFLs,并设置一组不加STF?31的空白对照。分别于24 h、48 h以及72 h进行下述指标观察：以MTT法检测STF?31对RAFLs细胞的增殖抑制效果;通过倒置显微镜观察STF?31作用后的细胞形态学改变;以ATP试剂盒分析STF?31作用后的RAFLs细胞内ATP水平;通过JC?1得到给药后RAFLs内线粒体膜电位的变化;以流式细胞术双染法观察STF?31作用于RAFLs细胞48 h后产生的细胞凋亡比率;应用Western blot法检测STF?31作用在RAFLs后的凋亡相关蛋白Bax、Bcl?2以及p?Akt的表达。结果 STF?31随着浓度增加、时间延长,可以更好地抑制RAFLs细胞的增殖(P<0.05),作用RAFLs细胞24 h、48 h和72 h的IC₅₀分别为9.870、1.400和0.513μmol/L;镜下观察到STF?31作用在RAFLS细胞后,RAL...     

成纤维样滑膜细胞microRNA与类风湿关节炎

<正>类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎性、系统性疾病,以对称性多关节炎为主要临床表现,最终导致关节软骨、韧带、肌腱等组织和脏器损害,是人类丧失劳动力和致残的主要原因之一。目前RA的发病机制不是很明确,但环境因素、遗传易感性、免疫功能紊乱被认为与其关系密切。因此,明确RA的发病机理,早期、准确的诊断,对于采取治疗措施以控制病情的发展、避免不可逆     

IL-32γ对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖与细胞周期的影响

目的:研究IL-32γ对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖与细胞周期的影响及机制。方法:体外培养活动性类风湿关节炎和骨关节炎(OA)患者成纤维样滑膜细胞并以IL-32γ处理,应用MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Western印迹方法检测cyclinD1及NF-κBp65蛋白含量;免疫细胞化学染色法检测PCNA表达的变化。结果:IL-32γ对OA-FLS增殖没有影响;不同浓度的IL-32γ(10～100 ng/ml)在72～120小时范围内,浓度和时间依赖性促进RA-FLS增殖;100 ng/ml的IL-32γ作用RA-FLS 48小时后促进了细胞周期由G1期向S期,进而G2/M期转化,同时上调了cyclin D1、NF-κBp65和PCNA的蛋白表达水平。结论:IL-32γ可促进RA-FLS增殖和加速细胞周期转化。上调NF-κBp65和cyclin D1的表达可能是其作用机制之一。     

IL-22对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的作用

目的:探究白细胞介素(IL)-22对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLSs)功能的影响及机制。方法:组织块法培养RA-FLSs。将不同浓度(0、1、10、100μg/L)的重组人源性IL-22(rhIL-22)与RA-FLSs共培养24 h、48 h、72 h,CCK-8法检测细胞活力的改变;利用10μg/L的rhIL-22作用于RA-FLSs 24 h,流式细胞术检测细胞周期改变。rhIL-22和/或信号转导和转录因子3(STAT3)特异性抑制剂STA-21以不同浓度作用RA-FLSs 24h,Western blot法检测Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的变化。结果:不同浓度的rhIL-22作用于RA-FLSs 24 h、48 h、72h后,RA-FLSs细胞活力明显增高,均显著高于对照组(P0.05)。rhIL-22刺激RA-FLSs后,S期和G_2/M期细胞明显增多,G_0/G_1期细胞减少。Western blot法检测结果提示rhIL-22可上调RA-FLSs中Bcl-2、p-STAT3的蛋白水平,而STA-21单用或联用rhIL-22均可抑制RA-FLSs中Bcl-2及p-STAT3的表达(P0.05)。结论:IL-22在RA-FLSs细胞活力和周期调节中起重要作用,且STAT3在IL-22促RA-FLSs细胞Bcl-2表达的过程中起关键作用,提示IL-22可能对RA-FLSs凋亡有一定的影响。     

MicroRNA-16对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞增殖、侵袭及细胞因子分泌的影响

 目的:研究microRNA-16（miR-16）对类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者滑膜成纤维细胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs）增殖、侵袭及细胞因子分泌的影响。方法: 体外分离培养RASFs,脂质体转染化学合成的miR-16 mimic或miR-16抑制剂,分别采用MTT法、Transwell小室法和流式细胞术检测其对RASFs增殖、侵袭及凋亡的影响;RT-PCR和Western blotting检测miR-16对RASFs基质金属蛋白酶3/13（matrix metalloproteinase 3/13,MMP3/13）及白细胞介素1β（interleukin 1β,IL-1β）表达的影响。结果:增殖实验结果表明miR-16可显著抑制RASFs的增殖;细胞侵袭结果表明miR-16可显著抑制RASFs的侵袭;流式细胞术检测发现miR-16对RASFs凋亡无显著影响;miR-16可下调MMP3/13及IL-1β的表达水平。结论:  miR-16在RA的发生中起着重要作用,它可能通过下调MMP3/13及IL-1β的表达抑制RASFs增殖和侵袭。这为进一步研究miR-16在RA中的作用机制奠定了基础。     

PTEN在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义

目的:探讨第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)在人类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达水平及意义。方法:利用组织块法获得并体外培养人RA-FLS、骨关节炎(OA)-FLS及关节创伤-FLS;采用实时荧光定量PCR法检测各组FLS中PTEN mRNA表达水平的差异;采用Western blotting法检测各组FLS的PTEN蛋白表达水平以及Akt Thr308位点磷酸化水平的差异。结果:(1)RA-FLS中的PTEN mRNA表达水平显著低于OA-FLS及关节创伤-FLS(P0.01),而OA-FLS与关节创伤-FLS之间的PTEN mRNA表达水平无统计学差异。(2)RA-FLS的PTEN蛋白表达水平显著低于OA-FLS及关节创伤-FLS(P0.05),而OA-FLS与关节创伤-FLS之间的PTEN蛋白表达水平无统计学差异。(3)RA-FLS中的Akt蛋白Thr308位点磷酸化水平显著高于OA-FLS及关节创伤-FLS(P0.01),且OA-FLS中该位点的磷酸化水平显著低于关节创伤-FLS(P0.01)。(4)RA-FLS中的PTEN蛋白水平与Akt Thr308位点磷酸化水平呈显著负相关(P0.01)。结论:RAFLS中PTEN基因呈低水平表达,可能与Akt Thr308位点磷酸化水平异常增高相关。     

沉默PGRN基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的：探讨沉默颗粒蛋白前体（PGRN）基因对类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法：按照脂质体法将siRNA PGRN、siRNA NC转染至RA滑膜成纤维细胞MH7A,记为siRNA NC组、siRNA PGRN组,对照组（Control）未进行转染处理;将siRNA PGRN转染RA滑膜成纤维细胞MH7A后,加入丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路激活剂Anisomycin,记为siRNA PGRN+Anisomycin组。采用qRT-PCR检测各组细胞PGRN mRNA表达水平;噻唑蓝（MTT）、克隆形成实验检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡变化;Western blot检测各组细胞PGRN、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原（PCNA）、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)蛋白、MAPK通路蛋白表达。结果：与Control组、siRNA NC组相比,siRNA PGRN组内PGRN mRNA及蛋白表达、克隆形成率、存活率明显降低,凋亡率明显升高,Cyclin D1、PCNA、Bcl-...     

miR-29a对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-29a对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)活力和凋亡的影响。方法分离培养健康人FLS(n-FLS)和RA患者FLS(RA-FLS);Western blot检测n-FLS和RA-FLS中标志物CHI3L1蛋白表达;将miR-29a mimics、si-NFAT5及miR-29a+NFAT5转染RA-FLSs,转染48 h后,RT-qPCR检测miR-29a和NFAT5 mRNA表达;MTT法及流式细胞计量术分别检测各组细胞活力和凋亡率;Western blot检测p38、p-p38、cleaved-caspase3蛋白表达;通过双荧光报告基因检测系统检测过表达或抑制miR-29a后NFAT5表达,验证miR-29a和NFAT5的靶向关系。结果与n-FLS比较,RA-FLS中CHI3L1蛋白表达明显升高(P<0.05);过表达miR-29a或抑制NFAT5后,RA-FLS细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,p-p38表达明显降低,cleaved-caspase3表达明显升高(P<0.05)。miR-29a与野生型NFAT5 3′UTR共转染组RA-F...     

雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL-18及其受体表达的影响

目的:研究雷公藤内酯醇(TP)对佛波酯(PMA)刺激的关节滑膜成纤维细胞(RASF) 白细胞介素18(IL-18)及其受体(IL-18R)表达的影响, 并对其机制进行探讨.方法:RASF先用TP(0～100 μg/L) 预处理2 h, 再用PMA (50 μg/L)刺激.收集上清用 ELISA 法检测上清IL-18水平.利用人IL-18能特异诱导人髓系单核细胞KG-1产生IFN-γ的特性检测上清中IL-18生物学活性.收集处理的RASF, 用Western blot 和荧光定量RT-PCR检测IL-18和IL-18R的蛋白和mRNA表达.NF-κB的活性用类ELISA法检测. 结果:TP能有效抑制PMA刺激的RASF的IL-18生物学活性.TP能够抑制PMA刺激的RASF的IL-18和IL-18R的蛋白和mRNA表达.TP还抑制PMA刺激的RASF 的NF-κB 活性.TP对PMA刺激的RASF 的抑制效应呈剂量相关性.结论:TP能有效抑制PMA刺激的RASF 的IL-18和IL-18R的表达.这些结果说明了TP对RA治疗作用的机制.     

TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMP-3的实验研究

目的:通过观察TWEAK在不同浓度下对RA FLS诱导合成MMP-3的影响,探讨TWEAK参与类风湿关节炎(RA)关节骨及软骨破坏的相关机制,进而寻求治疗RA的新途径.方法:将rhTWEAK与成纤维样滑膜细胞(FLS)共培养,应用ELISA法检测细胞培养液中MMP-3水平;用反转录-聚合酶反应(RT-PCR)检测FLS中MMP-3 mRNA的表达水平.结果:TWEAK终浓度为50、100μg/L组诱导RA FLS合成MMP-3的水平明显高于对照组,具有显著的统计学意义(P＜0.05);TWEAK终浓度为100μg/L诱导RA FLS的MMP-3 mRNA表达水平为对照组的1.26倍,具有显著的统计学意义(P＜0.05);TNF-α和IL-1β对TWEAK诱导RA FLS合成MMP-3及MMP-3 mRNA表达具有协同作用,协同作用组MMP-3的水平及MMP-3mRNA表达水平明显高于单纯TWEAK组,具有显著的统计学意义(P＜0.05).结论:TWEAK通过诱导RA FLS合成MMP-3,直接参与RA的关节损伤,TNF-α和IL-1β在此过程中发挥协同作用.     

成纤维样滑膜细胞通过IL-6下调类风湿关节炎患者外周血Treg北大核心CSCD

类风湿关节炎（ rheumatoid arthritis, RA）是以关节组织慢性炎症性病变为主的自身免疫性疾病,成纤维样滑膜细胞（ fibroblast-like synoviocytes, FLS）异常活化是RA发病的重要机制之一,通过释放大量炎症因子、募集其他炎性细胞等方式加重关节侵蚀破坏. 调节性T细胞（ regulatory T cell, Treg）是具有免疫负调节功能的T细胞亚群. 我们推测FLS在RA炎症环境中分泌的炎症因子可能会影响RA患者外周血Treg的比例,本研究旨在阐明RA-FLS对Treg细胞是否具有免疫调控作用及可能的作用途径.