酪氨酸家族激酶在大鼠脊髓背角LTP中的作用及其机制

目的: 探讨酪氨酸家族激酶(SFKs)在大鼠脊髓背角C纤维诱发电位的长时程增强(LTP)中的作用及其机制。 方法: 用在体电生理方法检测SFKs抑制剂对高频刺激坐骨神经诱导的脊髓背角LTP的影响;用Western blotting方法检测高频刺激诱导脊髓LTP的不同时点大鼠脊髓背角磷酸化SFKs的表达情况;用免疫荧光双染方法检测高频刺激诱导脊髓LTP后大鼠脊髓背角磷酸化SFKs表达的细胞学定位。 结果: SFKs的抑制剂(PP2或SU6656)可以完全阻断LTP的诱导,甚至将LTP逆转为长时程抑制(LTD);高频电刺激大鼠坐骨神经诱导脊髓LTP后15 min开始,刺激同侧的脊髓背角中磷酸化SFKs表达明显增加,并且这些高表达的磷酸化SFKs仅仅存在于脊髓小胶质细胞中。 结论: 在脊髓背角,小胶质细胞中的SFKs 是诱导LTP的必要条件,抑制SFKs及其下游分子可能有助于治疗病理性疼痛。     

PKA参与脊髓背角C-纤维诱发电位LTP的诱导和早期维持

目的: 探讨环一磷酸腺苷依赖的蛋白激酶 (PKA) 在脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强(LTP)的诱导和维持中的作用。方法:细胞外记录技术在脊髓腰膨大部记录背角浅层神经元C-纤维诱发电位。 结果:(1) 8-Br-cAMP诱发脊髓背角C-纤维诱发电位LTP,且8-Br-cAMP-诱导的 LTP 遮蔽强直刺激诱导的LTP。(2) PKA的选择性抑制剂Rp-CPT-cAMPS阻断C-纤维诱发电位LTP的诱导和时间依赖性翻转C-纤维诱发电位LTP。(3)蛋白质合成抑制剂茴香霉素彻底阻断8-Br-cAMP诱发的 LTP。(4)MAPK选择性抑制剂PD98059阻断8-Br-cAMP诱发的LTP。 结论:脊髓背角神经元存在PKA信号途径,并参与脊髓背角C-纤维诱发LTP的诱导和早期维持。     

脊髓背角长时程增强中CaMKⅡ磷酸化水平的变化

目的探讨长时程增强诱导和维持过程中脊髓背角钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)磷酸化水平的变化。方法(1)细胞外记录脊髓腰膨大部背角浅层神经元C-纤维诱发电位;(2)免疫组化技术观察脊髓背角CaMKⅡ磷酸化水平的变化。结果(1)LTP30min、LTP3h脊髓背角CaMKⅡThr286的磷酸化水平明显高于对照组;(2)强直刺激前30min脊髓局部给予KN-93(CaMKⅡ选择性抑制剂,100μmol/L),LTP的诱导被完全阻断,CaMKⅡ磷酸化水平与对照组无明显差别;(3)强直刺激后30min给予KN-93,明显抑制LTP,CaMKⅡ的磷酸化水平也显著降低;(4)LTP3h后给予KN-93,LTP幅度和CaMKⅡ磷酸化水平与用药前相比,差异没有统计学意义。结论CaMKⅡ磷酸化可能在脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强诱导和早期维持中发挥重要作用。     

ERKⅠ/Ⅱ在脊髓背角LTP的诱导和维持中的作用

目的：探讨胞外信号调节激酶（ERKⅠ/Ⅱ）在大鼠脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强（LTP）的诱导和维持中的作用。 方法： 细胞外记录技术在脊髓腰膨大部记录背角浅层神经元C-纤维诱发电位。 结果： (1) MEK的选择性抑制剂PD98059（100 μmol/L）或SL327 (200 μmol/L) 对脊髓背角C-纤维诱发电位的基础电位没有影响，但可阻断脊髓背角LTP的诱导。(2) PD98059或SL327呈时间依赖性逆转脊髓背角LTP。在LTP 诱导后15 min，脊髓局部给予PD98059（100 μmol/L）或SL327(200 μmol/L)可完全逆转LTP。在LTP 诱导后30 min，单独给予PD98059或SL327，LTP的抑制率分别为62.5％与75.0％。但同样浓度的PD98059或SL327在LTP 诱导后1 h，均不能逆转业已建立的LTP。 结论： 脊髓背角ERKⅠ/Ⅱ的激活参与C-纤维诱发电位LTP的诱导和早期维持。     

PKC在成年大鼠脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强的诱导和维持中的作用

目的：探讨蛋白激酶C (PKC) 在大鼠脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强（LTP）的诱导和维持中的作用。方法： 细胞外记录技术在脊髓腰膨大部记录背角浅层神经元C-纤维诱发电位。 结果：(1) PKC的选择性抑制剂chelerythrine（200 μmol/L）或G 6983（100 μmol/L）对脊髓背角C-纤维诱发电位的基础电位没有影响，但可完全阻断脊髓背角LTP的诱导。(2) Chelerythrine或G 6983呈时间依赖性翻转脊髓背角LTP。在LTP 诱导后15 min，脊髓局部给予chelerythrine（200 μmol/L）后，LTP逐渐降低，于给药后70 min降至对照水平；而G 6983（100 μmol/L）产生同chelerythrine相似的效应，在用药后110 min，LTP降至对照水平。但同样浓度的chelerythrine或G 6983在LTP 诱导后3 h，均不能翻转业已建立的LTP。结论： PKC参与脊髓背角C-纤维诱发电位LTP的诱导和早期维持，而不影响晚期LTP的维持。     

脊髓小胶质细胞SFKs介导rrTNF诱导的机械痛敏

目的观察Src-家族激酶(SFKs)的激活在外源性TNFα引起的机械痛敏中的作用。方法大鼠坐骨神经周围施加重组大鼠TNFα(rrTNF),免疫组化观察给药后1、7d脊髓背角SFKs表达的变化,同时在给予rrTNF前鞘内注射SFKs抑制剂PP2,行为学测试检测大鼠50%机械刺激撤足阈值的变化。结果坐骨神经周围施加rrTNF可引起SFKs在双侧L5脊髓背角的表达显著上调,且SFKs的表达仅存在于小胶质细胞。提前鞘内注射SFKs抑制剂可防止rrTNF引起大鼠机械痛敏。结论脊髓背角小胶质细胞SFKs信号途径的激活在rrTNF引起的病理性疼痛的产生中起作用。     

8-O-乙酰山栀子苷甲酸通过抑制脊髓背角JNK的磷酸化水平改善大鼠炎性痛的研究

目的:探究8-O-乙酰山栀子苷甲酸(8-O-acetyl-SM,8-Oa S)对于慢性炎性痛模型大鼠痛行为及脊髓背角星形胶质细胞内c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平的影响。方法:运用大鼠足底注射完全弗式佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)的方法建立慢性炎性痛模型;通过腹膜腔注射8-Oa S进行干预;采用von Frey丝测定大鼠足底50%机械性缩足反射阈值;应用免疫荧光组织化学染色法观察大鼠腰膨大节段脊髓背角胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及磷酸化的JNK(phosphorylatedc-Jun N-terminal kinase,p JNK)表达;应用Western Blot方法对大鼠脊髓背角内GFAP、JNK以及p-JNK的表达水平进行定量分析。结果:(1)行为学结果显示:与对照组相比,CFA模型大鼠机械性痛阈明显降低(P0.01),腹膜腔注射8-Oa S可有效提高CFA诱导的机械性痛阈值(P0.05);(2)免疫荧光染色结果显示:CFA模型脊髓背角内GFAP的表达量明显高于正常组,且p JNK基本表达于星形胶质细胞内;(3)Western Blot结果显示:与对照组相比,CFA造模后7 d脊髓背角内GFAP和p JNK表达明显上调,腹膜腔给予8-Oa S可以显著下调CFA诱导的脊髓背角内GFAP和p JNK的水平(P0.01)。结论:腹膜腔内给予8-Oa S可有效提高炎性痛大鼠的机械性痛阈,其机制是通过下调脊髓背角星形胶质细胞内JNK信号通路的磷酸化水平进而抑制星形胶质细胞的激活。     

糖皮质激素受体参与病理性疼痛调制的研究进展

<正>人们早已熟知外周的糖皮质激素受体(glucocorticoidreccptor,GR)在抗炎过程中起着重要的作用。近些年的研究发现GR广泛表达于中枢神经系统[1-3],在脊髓背角GR与神经元标记物NeuN(神经元特异核蛋白)、星形胶质细胞标记物GFAP(胶质纤维酸性蛋白)共表达[3-4];并且发现,在受到外周伤害性刺激时,脊髓背角表达GR的神经元同时表达     

白细胞介素-1β在病理性疼痛大鼠脊髓LTP中的作用及机制

目的: 探讨白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)在神经病理性疼痛大鼠脊髓背角C纤维诱发电位长时程增强(long-term potentiation, LTP)中的作用及其机制。方法: 用坐骨神经部分损伤(spared nerve injury, SNI)和腰5前根切断(lumbar 5 ventral root transection, L5 VRT)方法复制大鼠病理性疼痛模型,观察外源性IL-1β对正常大鼠及病理性疼痛模型大鼠脊髓背角C纤维诱发电位的影响,并且检测p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase)和NF-κB (nuclear factor-kappa B)信号通路在其中的作用。结果: 500 μg/L IL-1β对正常大鼠C纤维介导的基本突触传递和高频刺激诱导的LTP都没有影响,而5 μg/L的IL-1β可以在神经病理性疼痛模型的大鼠上诱导出LTP。预先用p38 MAPK或NF-κB的抑制剂(SB203580或PDTC)可以完全阻断IL-1β诱导的LTP。结论: 外源性IL-1β可诱导神经病理性疼痛大鼠脊髓背角C纤维诱发电位的LTP。p38 MAPK和NF-κB信号通路可能参与这一过程。     

皮质酮对大鼠脊髓背角星形胶质细胞活动的影响

目的:探讨皮质酮(corticosterone,CORT)对培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞活性的调节作用。方法:培养纯化新生SD大鼠脊髓背角星形胶质细胞,荧光双重标记技术检测培养的星形胶质细胞糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)共表达;免疫印迹技术检测星形胶质细胞GFAP表达的变化;高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测星形胶质细培养液中谷氨酸含量。结果:培养的脊髓背角星形胶质细胞均表达GR;CORT孵育3 h可降低脊髓背角星形胶质细胞GFAP表达,GR拮抗剂RU38486可阻断CORT的作用;但CORT对星形胶质细胞谷氨酸释放无显著影响。结论:CORT可降低脊髓背角星形胶质细胞GFAP表达,但对谷氨酸释放无显著影响。     

炎性痛致大鼠脊髓后角ProBDNF及其受体的表达变化

目的:探讨完全弗氏佐剂(complete Freund’s Adjuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓后角内ProBDNF及受体P75NTR和Sortilin的表达变化及意义。方法:大鼠随机分为正常组和实验组,实验组大鼠左侧足底皮下注射CFA和生理盐水混合溶剂100μl,建立炎性疼痛模型,实验组包括注射CFA后6 h、1、3、7和14 d组。采用Von Frey纤维测定不同时间点大鼠机械缩足阈值(pawwithdrawal threshold,PWT)的变化;采用免疫组织化学方法检测ProBDNF及P75NTR、Sortilin在脊髓后角的表达变化。结果:足底注射CFA后1 h PWT即下降,并在6 h后达到最低值,3 d后逐渐上调,至14 d仍低于基础值。ProBDNF在正常脊髓后角可见阳性表达;注射CFA后1 d注射侧脊髓后角较对侧其ProBDNF的表达明显上调,上调持续到7 d左右,至14 d逐渐恢复。正常大鼠脊髓后角P75NTR有较弱表达,主要集中在后角I、II层纤维;注射CFA后6 h开始,注射侧脊髓后角内P75NTR的表达明显上调,III-V层的阳性产物也逐渐增加,这种上调持续到7 d左右达高峰,至14 d逐渐下降。Sortilin在正常脊髓后角浅层仅有较弱阳性产物表达,注射CFA后不同时间点脊髓后角Sortilin的表达无明显差异。结论:CFA能诱导大鼠产生为期2周以上的炎性痛病程;脊髓后角ProBDNF和P75NTR的表达上调可能与炎性疼痛中外周痛觉信号的传导和中枢敏化有关。     

GDF10在神经病理性疼痛大鼠脊髓中的表达

目的:观察生长和分化因子10(GDF10)在神经病理性疼痛大鼠脊髓中的表达变化。方法:取雄性SD大鼠60只,通过结扎左侧L5脊神经制备神经病理性疼痛模型,于术前1 d,术后当天及术后1 d、3 d、10 d、21d检测大鼠左后爪50%缩爪阈值,并采用免疫荧光染色及Western blot检测大鼠L5脊髓后角GDF10的表达变化。结果:脊神经结扎大鼠在术后1 d缩爪阈值开始降低,自3 d起,与正常对照组相比差异有统计学意义(P0.05),到10 d阈值下降最明显,至21 d呈现持平状态。免疫荧光检测观察到伤侧L5脊髓组织中GDF10主要表达于脊髓背角神经元细胞的胞浆内。GDF10在术后持续降低,到10 d降低最为显著,与正常组相比差异具有统计学意义(P0.05),一直持续低水平表达至21 d。Western blot证实术后10 d脊髓中GDF10蛋白的表达较正常组大鼠明显降低(P0.05)。结论:大鼠脊神经结扎使脊髓背角中GDF10表达减少,其减少可能与大鼠脊神经损伤后对机械刺激引起的疼痛过敏有关联。     

不同延迟时间后修复大鼠坐骨神经缺损对CGRP表达的影响

目的：观察大鼠坐骨神经缺损不同延迟时间后修复对降钙素基因相关肽（CGRP）表达的影响.方法：大鼠右侧坐骨神经切断分别预变性0、3、7、14和21 d后（n=6）以左侧自体新鲜神经桥接,神经再生6周后用免疫组化方法检测CGRP在脊髓和背根节（DRG）的表达变化.结果：术侧DRG CGRP表达均明显增强,其中21 d组明显强于0 d组（P＜0.05）;术侧脊髓后角CGRP免疫阳性面积明显增大,21 d组明显大于0 d组（P＜0.05）,其CGRP表达在0 d、3 d和21 d组均强于对侧（P＜0.05）,而3 d和21 d组又明显强于0 d组（P＜0.05）;3d组脊髓前角的CGRP表达在明显强于0 d组和对侧（P＜0.05）.结论：预变性处理可以影响CGRP的表达从而影响神经再生过程.     

脊髓小胶质细胞P2X_4受体在rrTNF诱导的病理性疼痛中的作用

目的:研究P2X4受体在坐骨神经周围给予重组大鼠TNF-α(recombinant rat TNF-α,rr TNF)引起的机械痛敏中的作用。方法:采用雄性SD大鼠(180~200 g),Western blot检测坐骨神经周围给予rr TNF后3 d、7d和14 d脊髓背角P2X4受体的表达水平,免疫荧光双染观察脊髓背角P2X4受体的表达部位;在坐骨神经周围给予rr TNF的大鼠前鞘内注射TNP-ATP,行为学检测大鼠50%机械撤足阈值的变化,Western blot检测脊髓背角TNF-α的表达是否发生变化。结果:与对照组相比,坐骨神经周围给予rr TNF(100 ng/L)后3 d、7 d和14 d同侧脊髓背角P2X4受体的表达水平明显升高(P0.01);P2X4受体只表达于小胶质细胞中,神经元和星形胶质细胞中没有表达。坐骨神经周围给予rr TNF的大鼠前鞘内注射TNP-ATP可防止rr TNF诱导的机械痛敏并抑制脊髓背角TNF-α的上调。结论:小胶质细胞P2X4受体可能通过上调脊髓背角的TNF-α介导rr TNF诱导的机械痛敏。     

Expression of nerve growth factor in spinal dorsal horn following crushed spinal cord injury

Expression of nerve growth factor in spinal dorsal horn following crushed spinal cord injury     

突触后密度蛋白-95在大鼠脊髓发育过程中的表达变化

目的:探讨突触后密度蛋白-95(PSD-95)在大鼠脊髓发育过程中的表达变化以及细胞定位。方法:采用实时定量PCR(Real-Time PCR)和Western blot测定发育不同时期PSD-95 mRNA及蛋白水平的表达变化。采用免疫荧光染色显示PSD-95在发育脊髓中的细胞定位。结果:大鼠脊髓发育过程中PSD-95 mRNA及其蛋白水平从生后1d开始逐渐升高,在生后1周达高锋,成年后维持在一定的生理水平。免疫荧光双标证实PSD-95在生后发育早期主要定位于脊髓灰质,与神经元的标记物NeuN和突触的标记物synapsin存在共定位;成年后广泛分布于脊髓前角、后角以及白质,分别与NeuN和synapsin以及小胶质细胞的标记物OX-42共定位。结论:大鼠脊髓发育过程中PSD-95在基因和蛋白水平呈现明显的时相变化,在生后发育早期主要表达在前角运动神经元和后角感觉神经元,提示PSD-95参与了神经元的发育和成熟。     

Functional GABA(A)-receptor-mediated inhibition in the neonatal dorsal horn

Neonatal nociceptive circuits and dorsal horn cells are characterized by an apparent lack of inhibitory control: receptive fields are large and thresholds low in the first weeks of life. It has been suggested that this may reflect immature GABA(A)-receptor (GABA(A)R) signaling whereby an early developmental shift in transmembrane anion gradient is followed by a longer period of low Cl- extrusion capacity. To investigate whether functional GABA(A)R-mediated inhibition does indeed undergo postnatal regulation at the level of dorsal horn circuits, we applied the selective GABA(A)R antagonist gabazine to the spinal cord in anesthetized rat pups [postnatal day (P) 3 or 21] while recording spike activity in single lumbar dorsal horn cells in vivo. At both ages, blockade of GABA(A)R activity resulted in enlarged hind paw receptive field areas and increased activity evoked by low- and high-intensity cutaneous stimulation, revealing comparable inhibition of dorsal horn cell firing by spinal GABA(A)Rs at P3 and P21. This inhibition did not require descending pathways to the spinal cord because perforated patch-clamp recordings of deep dorsal horn neurons in P3 spinal cord slices also showed an increase in evoked spike activity after application of gabazine. We conclude that spinal GABAergic inhibitory transmission onto single dorsal horn cells "in vivo" is functional at P3 and that low Cl- extrusion capacity does not restrict GABAergic function over the normal range of evoked sensory activity. The excitability of neonatal spinal sensory circuits could reflect immaturity in other intrinsic or descending inhibitory networks rather than weak spinal GABAergic inhibition.     

保留后根的新型脊髓旁矢状面切片技术及其在脊髓突触传递研究中的应用

目的:对保留脊神经后根的脊髓切片技术进行改良,增加所保留的脊神经后根纤维投射到脊髓后角浅层的完整性,以提高实验效率。方法:选用4～5周的SD大鼠,应用振动切片机对其脊髓腰骶膨大分别进行横断面或矢状面切片,在全细胞模式记录下,给予后根刺激观察两者中诱发出兴奋性突触后电流(EPSCs)的成功率,并对其进行比较;调整后根刺激参数分别刺激Aβ、Aδ和C纤维以诱发EPSCs,并对不同纤维诱发的EPSCs进行鉴别。结果:在保留后根的横断面和矢状面切片上诱发出EPSCs的成功率分别是38.43±9.97%和86.36±5.32%,具有显著的统计学差异(P<0.0001);与非保留后根的脊髓切片上诱发出的EPSCs相比,应用保留后根的脊髓横断面切片和矢状面切片所诱发的EPSCs均可通过刺激强度和潜伏期的差异,对不同纤维诱发的EPSCs进行有效的区分。结论:保留后根的脊髓矢状面切片刺激后根反应率显著高于横断面切片,且可对不同纤维诱发的EPSCs进行有效区分。因此,保留后根的脊髓矢状面切片比横断面切片更完整的保留了后根到脊髓后角浅层的投射,可提高实验效率,是研究脊髓中枢突触传递及其可塑性的可靠离体模型。     

大鼠外周神经损伤后脊髓背角HMGB1表达上调参与机械性痛觉超敏

目的:研究HMGB1(high mobility group box-1)在神经病理性痛大鼠脊髓水平的表达变化,探索HMGB1在神经病理性痛发生发展中的作用,为治疗神经病理性痛提供新的理论依据和治疗靶点。方法:(1)雄性SD大鼠(180～220)g 12只,随机均分为三组:NS组:鞘内注射生理盐水;A组:鞘内注射HMGB1 1μg;B组:鞘内注射HMGB1 10μg。盲法用von Frey测定给药前及给药后1 h、1、3、7、14、21、28 d大鼠50%机械缩足阈值(me-chanical withdrawal threshold,MWT);(2)雄性SD大鼠(180～220)g 5只,免疫荧光双标观察HMGB1在脊髓背角的表达定位;(3)雄性SD大鼠(180～220)g 42只,随机均分为对照组(6只),SNL模型组(每时间点6只),West-ern Blot方法观察大鼠脊髓背角HMGB1对照及术后1、3、7、14、21、28 d的表达变化。结果:(1)大鼠脊髓鞘内注射HMGB1后诱发长时程机械性痛敏,A组在鞘内给药后7 d MWT明显下降(P<0.01),B组给药后1 h MWT即显著下降,且持续存在至少28 d;(2)免疫荧光双标显示:HMGB1主要表达于NeuN标记的神经元,而GFAP阳性的星形胶质细胞以及OX42阳性的小胶质细胞几乎不表达HMGB1;(3)Western Blot结果显示,脊髓背角HMGB1在SNL模型术后缓慢增高,7 d时增高最为显著,且持续至少28 d。结论:以上结果表明,外周神经损伤后脊髓水平HMGB1的表达上调可能在神经病理性痛的产生和维持中起着重要作用。