FAK基因沉默诱导白血病细胞凋亡

目的:本研究靶向黏着斑激酶(FAK)基因,构建FAK-shRNA慢病毒载体,并研究FAK基因沉默对白血病细胞生长的影响。方法:化学合成人FAK基因的shRNA序列,应用分子生物学方法将该FAK shRNA序列插入含荧光素GFP慢病毒质粒。该FAK shRNA慢病毒载体在体外包装、浓缩,然后转染至人白血病细胞株。应用逆转录聚合酶链反应及蛋白质印迹方法检测FAK基因表达水平,予Annexin V标记检测细胞凋亡的情况。结果:经核苷酸序列分析提示FAK shRNA正确插入慢病毒质粒,该病毒载体在白血病细胞株的转染率为10%-25%。与对照组相比(无FAK shRNA的慢病毒载体),FAK shRNA慢病毒载体在细胞FAK mRNA及蛋白水平的抑制率分别为40%和70%。凋亡实验表明,对照组与FAK shRNA慢病毒载体组的Annexin V阳性率分别为(4.19±0.36)%和(8.48±0.58)%,两者差异明显(P0.05)。结论:我们成功构建FAK shRNA慢病毒载体,该载体能抑制FAK基因表达并诱导白血病细胞凋亡。     

基因转移及其诱导的肿瘤细胞凋亡

凋亡是一种特殊类型的细胞死亡，受某些基因及分子的调控。基因转移可导肿瘤细胞凋亡，根据不同肿瘤基因变异或基因表达的特点，采用不同的目的基因对肿效率细胞进行基因修饰以诱导细胞凋亡的发生可能成为肿瘤免疫基因治疗的有效手段。     

CREG调控IGF2R/IGFII内吞抑制人血管平滑肌细胞增殖

目的: 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)抑制人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的机制。方法: 应用逆转录病毒载体pLNCX₂-CREG和pSM2-siCREG分别转染VSMCs,G418和puromycin筛选得到稳定转染细胞VSMCs-CREG和VSMCs-siCREG;Western blotting检测转染前后细胞CREG的表达;BrdU和流式细胞术检测CREG表达及对VSMCs增殖的影响。Western blotting和免疫荧光染色检测细胞胰岛素样生长因子Ⅱ受体(IGF2R)的表达;ELISA和RT-PCR检测胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)的表达;Alexa 488标记重组IGFII内吞实验观察CREG表达对IGFII内吞的影响;重组IGF2R和anti-IGF2R中和抗体阻断实验观察IGF2R-IGFII内吞作用对细胞增殖的影响;Western blotting检测细胞增殖信号分子PI3K/Akt和ERK表达,抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞增殖中的作用。结果: 实验分别得到VSMCs-CREG和VSMCs-siCREG的细胞克隆,VSMCs-CREG中CREG表达增加,而VSMCs-siCREG中CREG表达减少。VSMCs-CREG细胞增殖较正常对照组明显受抑,VSMCs-siCREG细胞增殖显著增加。 VSMCs-CREG细胞中IGF2R蛋白在细胞膜上的表达及分布均显著增加,而VSMCs-siCREG细胞中IGF2R在膜上分布明显下降。CREG过表达促进IGF2R对IGFII的内吞作用,抑制了IGFII的分泌。IGFII分泌增加启动了 CREG 沉默后VSMCs的增殖,PI3K/Akt和MAPK/ERK信号协同参与了IGFII对VSMCs增殖的调控作用。结论: CREG通过调控IGF2R在细胞膜的分布,加速IGFII内吞作用,抑制了体外培养VSMCs的增殖。     

E1A激活基因阻遏子蛋白对抗人脐静脉血管内皮细胞的凋亡

背景：前期研究显示,E1A激活基因阻遏子能够通过抑制动脉平滑肌细胞的凋亡对抗动脉粥样硬化。 目的：进一步阐明E1A激活基因阻遏子在内皮细胞凋亡中的作用。 方法：通过去血清方法诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞凋亡,然后进行TUNEL和caspase-3的活性检测。 结果与结论：伴随着E1A激活基因阻遏子的表达下降,内皮细胞的凋亡增多。功能获得和功能缺失分析显示：E1A激活基因阻遏子过表达后能够明显抑制内皮细胞的凋亡,而E1A激活基因阻遏子表达减少可以明显增加诱导内皮细胞的凋亡。进一步应用Western blot分析显示：E1A激活基因阻遏子对于内皮细胞凋亡的保护作用主要通过激活PI3K/AKT信号通路介导。提示E1A激活基因阻遏子对抗去血清诱导的内皮细胞凋亡中具有重要的作用。并且,E1A激活基因阻遏子抑制的内皮细胞凋亡可能通过PI3K/AKT信号转导通路。     

肿瘤特异性凋亡基因诱导人淋巴瘤细胞凋亡的机制

目的:研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptingene)在诱导人淋巴瘤细胞U937凋亡时,cJun氨基末端激酶(JNK)信号通路的作用。方法:用含有apoptin基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养的人淋巴瘤细胞U937。采用流式细胞仪、Westernblot、台盼蓝染色及RTPCR等研究其在不同时间条件下诱导U937细胞凋亡的作用。结果:Apopin基因瞬时转染U937细胞48h,可出现明显的凋亡;而且凋亡细胞的数量与apoptin基因的转染时间有关。诱导后24h,U937细胞中出现磷酸化的JNK蛋白的表达,诱导后48h达高峰;而非磷酸化的JNK蛋白表达无明显变化。结论:Apoptin基因具有诱导U937细胞凋亡的作用。JNK信号通路的激活,可能在apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用。     

Persephin基因转染对缺氧诱导的神经干细胞凋亡的影响

目的:探讨重组腺病毒介导Persephin基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法:体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型;将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞;Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数,显微镜观察凋亡小体;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。结果:转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞成功表达Persephin蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡指数为(25.54±4.30)%,而转染pAdPersephin后的细胞凋亡指数显著减少至(10.04±1.32)%(P<0.01),而转染pAdCMVPersephin Persephin反义寡核脱氧核酸细胞凋亡指数为(24.05±3.05)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性。     

肿瘤特异性凋亡基因诱导人黑色素瘤细胞凋亡机制的研究

目的研究肿瘤特异性凋亡基因(Apoptin gene)在诱导人黑色素瘤细胞A375发生凋亡时,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在细胞发生凋亡中的作用。方法用含有肿瘤特异性凋亡(Apoptin)基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375;采用流式细胞仪、免疫印迹法(W estern b lot)、台盼蓝染色法及RT-PCR等方法研究其在不同时间条件下对人黑色素瘤细胞A375诱导凋亡的作用。结果Apoptin基因瞬间转染的人黑色素瘤A375细胞出现明显的细胞凋亡,凋亡细胞的数量随Apoptin转染时间延长而增多,磷酸化型JNK蛋白在转染Apoptin 24 h开始表达,48h和72h过表达,而非磷酸化型JNK蛋白表达无明显变化。结论Apoptin基因具有诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡的作用,JNK信号通路的激活可能在Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥作用。     

细胞凋亡相关基因研究进展

细胞凋亡研究已成为当今国内外研究的新热点,本文就近年来有关与细胞凋亡相关的基因或因子研究的进展做一综述,着重阐述了bcl-2、myc、p53和APO-l/Fas以及TGFβ_1等对细胞 凋亡的影响和作用,以期有助于进一步揭示细胞凋亡的分子机理。     

白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的基因调控

目的　探讨白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中的基因调控作用。方法　经小鼠尾静脉注射白色念珠菌后 ,采用FCM技术测定胸腺凋亡细胞上 5个凋亡相关基因 ( p5 3,bax ,bcl 2 ,fas和c myc)产物的水平在不同时间组的变化。结果　p5 3和bax两个基因产物的水平明显增加 ;而bcl 2 ,fas和c myc基因产物的水平无明显改变。 结论　白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡 ,可能是经由基因调控的转录途径机制而发生 ,p5 3和bax基因在此过程起重要作用     

转染FasL基因树突状细胞诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的研究

目的 制备稳定表达FasL蛋白的小鼠骨髓源树突状细胞(dendritic cell,DC)并探讨其诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的机理.方法 采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,脂质体法转染FasL基因至小鼠成熟DC,实时定量PCR检测转染前后FasL mRNA的表达,流式细胞仪和免疫蛋白印迹检测转染前后FasL蛋白的表达.异系小鼠静脉分别输注未转染DC、转染空质粒DC和转染FasL的DC,7 d后TdT介导的原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞凋亡.结果 体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC,转染FasL基因的DC较未转染DC FasL mRNA和FasL蛋白表达明显升高.对脾脏中T淋巴细胞凋亡的检测发现,转染FasL的DC组凋亡指数(11.67±1.53)明显高于未转染DC组(2.67±0.58)和转染空质粒组(3.33±0.58),P＜0.01.结论 培养基选择法可收获大量骨髓源DC,脂质体转染FasL基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达FasL蛋白.转染FasL的DC输注能明显诱导异系小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡.     

类胚体中残留胚胎干细胞数量与其致瘤性相关性的初步研究

目的 探讨类胚体(EBs)中残留未分化胚胎干细胞(ESCs)的数量与其致瘤性的相关性.方法 小鼠R1胚胎干细胞株,体外类胚体诱导分化10d,流式细胞仪检测残留未分化ESCs表面标志SSEA-1阳性率.将第10天EBs消化打散后重新给予ESCs常规培养体系培养,观察EBs中残留未分化ESCs形态,流式细胞仪检测残留细胞表面标志物;第10天EBs消化打散后以104～2×106细胞量分别注射至裸鼠四肢肌肉内,观察不同细胞数量与畸胎瘤形成的相关性.结果 ESCs分化为EBs 10 d后有(13.5±0.75)%的细胞表达SSEA-1,提示存在残留未分化ESCs.残留未分化细胞生长形态呈克隆样,高表达SSEA-1等未分化ESCs标志.EBs消化打散后仅在注射2×l06个细胞的部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织,其余各组均未见畸胎瘤的形成.结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化胚胎干细胞,并需要一定细胞数量才具有致瘤性.     

RNA干扰Rbl-2基因调控DNA甲基化转移酶介导心脏干细胞凋亡

目的:视网膜母细胞瘤样蛋白2(Rbl-2)在调控DNA甲基化转移酶(DNMT)中发挥重要作用,而DNMT影响干细胞的分化。本文旨在探讨调控Rbl-2基因的表达对心脏干细胞凋亡的影响。方法:分离培养人心脏干细胞,转染Rbl-2 siRNA。采用real time RT-PCR检测Rbl-2和DNMT-3B mRNA表达水平,Westernblotting检测DNMT-3B蛋白表达和caspase-3活化片段,并以Annexin V-FITC/PI双染色-流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:在人心脏干细胞中,转染siRNA后Rbl-2 mRNA表达水平与阴性对照组相比显著降低(P0.01),同时DNMT-3B mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组相比均显著升高(P0.01),差异显著。与阴性对照组相比,转染Rbl-2 siRNA的人心脏干细胞caspase-3激活,表现为caspase-3活性片段与caspase-3前体的比值显著增高(P0.01),annexin V阳性细胞凋亡率上升(P0.05)。结论:Rbl-2基因在心脏干细胞的生存中具有正性调控作用,抑制其表达能促进心脏干细胞的凋亡,其调控机制与表观遗传学的修饰密切相关。     

低氧对人胚胎干细胞多能性维持及印迹基因表达稳定性的影响

目的 研究低氧对人胚胎干细胞(hESC)生物学特性维持及印迹基因表达状态的影响.方法 在低氧(5％O2)条件下持续培养FY-hES-7细胞并采用细胞免疫荧光染色、RT-PCR等方法对其胚胎干细胞特性进行鉴定.运用全基因组基因表达谱芯片技术及实时荧光定量PCR方法检测FY-hES-7早期(第32代)和晚期(第52代)细胞的55个印迹基因表达状态.所有检测同时以常氧(21％ O2)培养作为对照.结果 低氧条件下长期培养的FY-hES-7细胞具有和常氧条件下培养相似的生物学特性,阳性表达干细胞表面标志SSEA-3、SSEA-4、TRA- 1-60、TRA-1-81及碱性磷酸酶(AKP),但细胞克隆形态较常氧培养下典型,且未分化状态保持时间较常氧条件下更长.低氧长期培养后FY-hES-7细胞的55个印迹基因中,有15个印迹基因(27.27％)表达发生了变化(上调8个,下调7个),而常氧培养后则有39个印迹基因表达水平有变化(70.91％)(上调21个,下调18个),氧浓度对印迹的影响差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 低氧更有利于hESC生物学特性的维持.长期培养能对hESC的印迹表达产生影响,但低氧培养条件下hESC的印迹稳定性要明显好于常氧培养.     

沉默JAG1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

 目的:探究沉默Jagged 1 (JAG1)基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其分子生物学机制。方法:
用已构建的pRS-JAG1重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞, 采用Western blotting方法检测重组质粒对JAG1蛋白表达的影响;MTT比色法测定沉默JAG1对细胞生长的抑制情况;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;蛋白印记分析细胞周期蛋白1(cyclin D1)、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb、Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的变化。结果:Western blotting结果证实重组质粒可在72h内有效抑制JAG1蛋白表达;人乳腺癌MDA-MB-231细胞JAG1被沉默后,细胞的生长速度明显减慢,细胞明显阻滞于G 0/G 1期,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),cyclin D1、p-Rb、Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平被下调(P<0.05),而p21CIP1/WAF1、p27KIP1、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论:沉默JAG1可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡。本研究为以JAG1为分子靶点的三阴乳腺癌治疗提供实验依据。     

Clk-1 deficiency induces apoptosis associated with mitochondrial dysfunction in mouse embryos

Clk-1 gene encodes demethoxyubiquinone hydroxylase that catalyzes the production of coenzyme Q (CoQ) in mitochondria. Clk-1-deficient mice that lack CoQ fail to survive beyond the embryonic day 10.5 (E10.5). However, the relationship between the clk-1-deficiency and embryonic lethality remains unclear. We show in this study that TUNEL-positive cells are frequently observed in whole bodies of clk-1-deficient mouse embryos at E10.5. In addition, dissociated cells from the embryos exhibited characteristic features of apoptosis, such as externalization of phosphatidylserine on the plasma membrane, caspase-3 activation, and the release of cytochrome c from mitochondria into the cytoplasm, as the first sign of mitochondria-mediated apoptosis. In embryonic cells, the mitochondrial functions such as maintenance of the mitochondrial membrane potential and intracellular ATP level were impaired. Since exogenous CoQ10 rescued the mitochondrial dysfunction and suppressed apoptosis in clk-1-deficent cells, we propose that clk-1-deficency induces apoptosis associated with mitochondrial dysfunction due to a lack of CoQ, which may lead to embryonic lethality in mice around E10.5.     

肽聚糖通过TLR2诱导人绒毛外滋养细胞的凋亡及意义

目的初步研究肽聚糖通过Toll样受体2(TLR2)诱导人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1细胞的凋亡及其意义。方法免疫细胞化学检测TLR2蛋白在TEV-1细胞的定位表达,不同浓度肽聚糖刺激TEV-1细胞后AnnexinV/PI流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果①TEV-1细胞表达TLR2,且定位于细胞膜和细胞浆。②30μg/ml肽聚糖刺激TEV-1细胞24小时后与对照组比较,细胞凋亡率无明显增加(8.17±0.1%,P>0.05),而刺激时间延长至48h可诱导出明显增加的细胞凋亡(16.03±1.51%,P<0.01);大剂量组80μg/ml肽聚糖刺激TEV-1细胞24h、48h均可诱导明显增加的细胞凋亡(14.13±1.06%和51.67±1.56%,P<0.01)。结论人绒毛外滋养细胞株TEV-1表达TLR2,肽聚糖可通过TLR2诱导TEV-1细胞凋亡,且存在时间和剂量依赖性,提示宫内感染时G+菌可能通过TLR2介导胎盘滋养细胞凋亡来影响妊娠的结局。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。 目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓间充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7 d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。 结果与结论：慢病毒转染3 d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90%以上,实验组转染效率达85%以上。RT-PCR和Western blot检测结果显示, 环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Caspase-3基因沉默对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的:通过siRNA抑制caspase-3基因的表达探讨肺炎链球菌对肺泡上皮细胞凋亡的影响及凋亡基因caspase-3对凋亡的调节作用,寻找治疗肺炎链球菌肺炎的新方法。方法:体外培养肺泡上皮细胞A549,用肺炎链球菌R6作用于A549细胞,使用siRNA技术抑制caspase-3表达,RT-PCT法检测caspase-3转录强度,化学荧光测定法检测caspase-3蛋白含量,ELISA法检测细胞上清中IL-6和IL-10浓度,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:肺炎链球菌能诱导A549细胞凋亡、导致caspase-3的表达和IL-6的浓度升高、IL-10的浓度降低;使用siRNA抑制caspase-3表达后,caspase-3的表达降低,A549细胞的凋亡率降低,而IL-6和IL-10的浓度并无明显变化。结论:Caspase-3在肺炎链球菌引起的肺泡上皮细胞的凋亡中占据了重要的地位;运用RNA干扰技术抑制caspase-3的表达能降低肺泡上皮细胞的凋亡率,这可能对肺炎链球菌肺炎的治疗有积极意义。