表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗的构建及其活性鉴定

为构建膜表达糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的结核杆菌早期分泌靶抗原6 kD(ESAT-6)和分泌IL-21的B16F10瘤苗并鉴定其活性,利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒,以脂质体转染重组质粒到B16F10细胞,G418筛选出阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光、FCM和Western blot检测瘤苗细胞靶抗原表达,用瘤苗细胞培养上清刺激小鼠CD8+T细胞,检测瘤苗所分泌IL-21的生物学活性。结果表明,pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒DNA测序正确,B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗细胞目的基因ESAT-6表达于瘤苗细胞表面,增殖能力未受外源基因导入影响,分泌的IL-21具有生物学活性,为研究膜表达ESAT-6和分泌表达IL-21瘤苗的抗瘤效应奠定了基础。     

表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗免疫鼠伴发自身免疫损伤初探

初步探讨B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱导抗肿瘤免疫的同时伴发自身免疫相关毒性作用。采用Western blot方法检测B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫小鼠自身抗体产生情况;采用免疫荧光技术检测瘤苗免疫小鼠血清对正常小鼠眼、睾丸、皮肤、肝及肾组织冰冻切片的反应;瘤苗免疫小鼠的生殖功能检测。结果显示B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫会引起部分C57BL/6小鼠发生鼠毛色素脱失现象,其免疫血清可同皮肤、睾丸等组织正常成分发生抗原抗体反应,瘤苗免疫过的雌雄小鼠合笼后能够正常繁育子代小鼠。实验说明B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱发小鼠产生抗肿瘤免疫反应的同时,部分受试鼠可伴发自身免疫损伤,但对机体并未产生危及生命的严重病理反应。本实验为全面评估B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗应用价值奠定了基础。     

GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗的构建及其免疫功能初探

目的构建糖基化磷脂酰肌醇(GPI)修饰的结核杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)核酸疫苗,初步分析其免疫功能。方法利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi重组体,转染B16F10细胞,G418筛选阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光检测转染细胞的ESAT-6抗原表达情况;采集ESAT-6核酸疫苗免疫鼠血清,分别检测抗体滴度和CDC效应,免疫磁珠法分选CD4+和CD8+T细胞,CFSE/7-AAD细胞毒实验分析CTL细胞毒活性。结果测序正确的重组体pIRES-ESAT-6-gpi转染细胞后,ESAT-6表达于细胞膜表面。ESAT-6核酸疫苗免疫血清和CD8+T细胞分别通过CDC效应和细胞毒作用杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞。结论构建的GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗能够诱导免疫鼠产生体液和细胞免疫反应,杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞,为进一步基于该法构建B16F10瘤苗的抗肿瘤免疫效应及机制研究奠定了基础。     

结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。     

IL-21对慢乙肝患者HBeAb生成与B淋巴细胞增殖的促进作用

目的研究IL-21对慢性乙型病毒型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)的促抗体分泌作用以及促B细胞增殖作用。方法以流式细胞术检测体外培养基线水平0 d和7 d的PBMC中B淋巴细胞的增殖及分化情况;用ELISA法检测培养上清液中HBeAb-IgG水平。结果①体外培养7 d后,各刺激组的B淋巴细胞均有明显增殖(P<0.01);与0 d时比较,IL-4与IL-21刺激组增殖最为显著(P<0.05)。②培养7 d后,各刺激组均可检测到HBeAb-IgG分泌,其中以IL-21刺激组产生的HBeAb水平明显增高,差异显著(P<0.05);而IL-4与IL-10刺激组无明显差别(P>0.05)。结论 IL-21具有促进B淋巴细胞增殖和HBeAb-IgG分泌的作用,在HBeAg(+)慢乙肝患者HBeAg血清学转换中可能发挥一定作用。     

结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的构建结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒。方法采用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B及ESAT-6基因,将其分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子重组质粒。进行酶切分析及序列测定后,用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及ESAT-6的表达。结果核酸序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及ESAT-6mRNA。结论成功构建了结核杆菌Ag85B及ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

重组CFP-10/ESAT-6抗原ELISA法对活动性肺结核诊断的评估

目的 以rCFP-10/ESAT-6融合蛋白抗原、植物血凝素(PHA)、生理盐水分别处理活动性肺结核患者外周血致敏T淋巴细胞,测定同一标本IFN-γ释放水平,探讨其对结核感染与发病的诊断意义.方法 病例组111例为临床确诊肺结核患者,对照组292例为经胸部透视和结核菌素试验(FeD)筛选的大学生.入选对象取血3.0 ml,均分为3份,每管1.0 ml,分别加入rCFP-10/ESAT-6融合蛋白、PHA和生理盐水,孵育后ELISA法测定IFN-γ的吸光度(A)值及其抗体.结果 rCFP-10/ESAT-6融合蛋白处理:IFN-γ测定值病例组x=1.3885±0.6236,对照组x=0.2944±0.0917,组间t'=16.4259,P90%,且无论特异性或非特异性处理,活动性肺结核患者IFN-γ释放水平均明显升高,血清抗体阳性率也高于对照组.     

糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探

目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

IL-21 / BCL-6 / Blimp-1 在囊性包虫病中的表达特点研究

目的:研究IL-21/ BCL-6/ Blimp-1 在囊性包虫病患者体内的表达,和参与包虫病发病的作用机制。方法:收集27 例新疆医科大学第一附属医院住院肝包虫病患者及同期30 名健康体检者的外周静脉血。用ELISA 方法检测血浆IL-21 水平,确诊的CE 患者用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测患者外周血单个核细胞中IL-21/ BCL-6/ Blimp-1 mRNA 的表达量。同时,在包虫病患者组中追踪17 例治愈者,测定其在治疗前、治疗后IL-21/ BCL-6/ Blimp-1 的表达量。结果:(1)实时荧光定量PCR 结果显示,与健康对照组相比,囊性包虫病患者外周单个核细胞中IL-21/ BCL-6 mRNA 水平明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。但Blimp-1 升高不明显。在包虫病治疗前治愈后的结果对比中可观察到IL-21/ BCL-6/ Blimp-1 mRNA 的表达下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(2)ELISA 方法结果显示,CE 患者外周血清中IL-21 水平与健康对照组相比显著升高并在治愈之后基本回至正常水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。IL-21 与BCL-6 呈正相关(r =0.733,P<0.01);IL-21 与Blimp-1 无相关性(P=0.179);Blimp-1 与BCL-6 无相关性(P = 0.157)。结论:在人感染细粒棘球蚴的病程发展中,BCL-6、Blimp-1 可能通过调节IL-21 的表达,促进人体免疫系统抵抗寄生虫感染。IL-21、BCL-6、Blimp-1 在手术有效治疗后明显下降,表明这三种因子参与了包虫病发展的免疫机制。     

上调RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响

目的研究核糖核酸酶抑制因子基因表达对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI,稳定转染B16-F10细胞。RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测RI的表达;HE染色及相差显微镜观察细胞形态;FITC标记的鬼笔环肽染色,激光共聚焦观察细胞骨架;黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测EMT及转移相关蛋白的表达;分别将各组B16-F10细胞眼眶静脉注射到c57/BL小鼠,建立肺转移动物模型,注射3周后处死小鼠。取肺称重,在解剖镜下计数肺转移结节数;肺组织切片HE染色观察肿瘤细胞转移;免疫组化检测肺转移瘤组织中转移及EMT相关蛋白的表达。结果 RI表达上调后,细胞由间质型向上皮型转换,细胞骨架重排;B16-F10-RI细胞组黏附、迁移和侵袭能力下降;与对照组相比,B16-F10-RI细胞中MMP2、MMP9、snail、slug、vimentin、twist和N-cadherin的表达明显降低,而E-cadherin,nm23-H1蛋白的表达明显增加(P0.01或P0.01)。实验组与对照组比小鼠肺的转移结节明显减少,同时EMT及转移相关蛋白在瘤组织中表达与体外细胞一致。结论上调核糖核酸酶抑制因子能够显著抑制B16-F10细胞EMT及侵袭、转移,RI可望作为治疗黑色素瘤的靶蛋白。     

IL-21 gpi和sGM-CSF共同修饰的瘤苗构建及其抗肿瘤效应

目的:构建膜锚定IL-21和分泌性GM-CSF(sGM-CSF)双表达瘤苗,并对其抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法:用分子生物学方法构建双表达IL-21 gpi和sGM-CSF重组质粒,将鉴定过的重组质粒以脂质体转染B16F10细胞制成瘤苗,用流式细胞仪检测转染瘤苗IL-21 gpi和sGM-CSF的表达.以瘤苗治疗荷瘤鼠,经观察小鼠肿瘤体积、生存率来分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗治疗鼠的细胞免疫活性.结果:正确构建了pRSC/IL-21 gpi-sGM-CSF重组质粒,转染细胞可很好地表达膜锚定IL-21和分泌性GM-CSF,制备的瘤苗能有效地发挥抗肿瘤效应,其机制与瘤苗治疗鼠的脾细胞增殖活性、NK细胞及CD8+细胞细胞毒活性增强有关.结论:成功构建了具有抗肿瘤活性的膜锚定IL-21和分泌性GM-CSF双表达瘤苗,为进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6

目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值。方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液原液及经透析袋浓缩10倍的脑脊液浓缩液中CFP10和ESAT-6。结果:TBM患者脑脊液原液CFP10检测敏感度为13.04%、特异度为100.00%,ESAT-6的敏感度为13.04%、特异度为100.00%;而浓缩液CFP10的敏感度为78.26%、特异度为96.42%,ESAT-6的敏感度为76.09%、特异度为98.18%。结论:应用反透析方法浓缩脑脊液,使用抗CFP10和ESAT-6 ELISA检测脑脊液CFP10和ESAT-6能显著提高其敏感度,是一种简单、快速早期诊断结核性脑膜炎的有效辅助方法。     

Antitumor efficacy of viable tumor vaccine modified by heterogenetic ESAT-6 antigen and cytokine IL-21 in melanomatous mouse

The goal of this study was to investigate whether glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored 6?kDa early secreted antigenic target (ESAT-6) and IL-21-producing B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21 viable vaccine would induce antitumor efficacy. Mice were immunized with B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21 vaccine and challenged by B16F10 cells 2?weeks later. Antitumor efficacy and mechanisms of the vaccine were analyzed. Vaccination with the viable B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21 vaccine resulted in an increase of IFN-γ level and the CD8(+)CTL cytotoxicity, a decrease in TGF-β generation and increase in the expression of miR-200c that serves as melanoma suppressor by directly targeting zinc-finger E-box binding homeobox 1 to inhibit epithelial-mesenchymal transition and block tumor metastasis. The vaccine significantly inhibited the melanoma growth, reduced the lung melanoma nodules, and prolonged the mouse survival compared with the controls. These findings highlighted IL-21 as an immune adjuvant in an engineered viable tumor vaccine to reinforce heterogenetic antigen ESAT-6 immune tolerance break to induce powerful antitumor efficacy in mice.